本文關(guān)鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過PI3K-Akt-mTOR通路調(diào)控鵝原代肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的研究

  更多相關(guān)文章： 鵝原肝代細(xì)胞 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 PI3K-Akt-mTOR通路 脂質(zhì)代謝

【摘要】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠誘導(dǎo)嚙齒類動物和人類肝脂肪變性模型已經(jīng)被報(bào)道,同時最近研究顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肝脂肪沉積中起重要調(diào)控作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活脂肪合成的轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1C水解導(dǎo)致脂肪合成酶的誘導(dǎo)表達(dá)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與通過抑制ApoB100分泌導(dǎo)致VLDL的分泌受損有關(guān)聯(lián)。但PI3K-Akt-mTOR信號通路通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控脂質(zhì)代謝的作用鮮有研究。本實(shí)驗(yàn)通過PI3K-Akt-mTOR信號通路抑制劑LY294002、NVP-BEZ235、Rapamycin處理鵝肝細(xì)胞后用衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,采用熒光定量PCR法檢測基因定量,western blotting蛋白檢測法,Elisa試劑盒檢測法以及油紅O染色法檢測脂肪酸合成,脂肪酸氧化及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的相關(guān)指標(biāo)來反映脂質(zhì)代謝的變化,分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對肝臟脂質(zhì)代謝的作用以及PI3K-Akt-mTOR信號通路的介導(dǎo)作用,為探討PI3K-Akt-mTOR信號通路與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝作用的分子機(jī)制及其基因水平的調(diào)控提供理論依據(jù),我們得到的研究結(jié)果如下：1.相比空白對照組用0.2μmol/L、2μmol/L、20μmol/L衣霉素處理細(xì)胞24小時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因BIP、EIF2a、ATF6、XBP1表達(dá)水平顯著升高(P0.05),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵蛋白BIP/GRP78蛋白濃度顯著升高(P0.05),表明在鵝肝細(xì)胞衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激成功。2.衣霉素處理細(xì)胞引起mTORc1的mRNA的表達(dá)顯著降低,PI3K和S6K的mRNA表達(dá)增加(P0.05),對Akt1基因的mRNA表達(dá)則沒有顯著影響。同時PI3K、mTOR、S6K酶的活性,與對照組相比,mTOR的蛋白表達(dá)含量降低,而PI3K和S6K蛋白活性增加,表明衣霉素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以調(diào)控PI3K和mTORcl基因。3. 用LY294002、NVP-BEZ235、Rapamycin處理鵝肝細(xì)胞降低衣霉素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因BIP、EIF2a、爿TF6、XBP1的升高(P0.05),降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵蛋白BIP/GRP78的蛋白濃度的升高(P0.05),NVP-BEZ235、Rapamycin的抑制作用顯著高于LY294002的作用(P0.05),NVP-BEZ235和Rapamycin之間差異不顯著,表明抑制劑LY294002、NVP-BEZ235、Rapamycin能抑制衣霉素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。4. 衣霉素處理細(xì)胞引起細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著增加,細(xì)胞內(nèi)VLDL含量減少,油紅O染色顯示細(xì)胞內(nèi)脂滴顆粒增多,脂質(zhì)沉積明顯；基因FAS、ACCα、PPARγ、 PPARα、CPT1、 MTP、ApoB、DGAT1、DGAT2的mRNA表達(dá)量比對照組顯著減少,SREBP-1表達(dá)量增加(P0.05),其中,ACOX1基因mRNA表達(dá)量與對照組無明顯差異；酶活顯示相比對照組衣霉素處理細(xì)胞后FAS、CPT、MTP蛋白濃度降低(P0.05),ACC蛋白濃度無明顯差異；western blotting結(jié)果表明衣霉素抑制CPTl蛋白的蛋白表達(dá)。這些結(jié)果表明,鵝肝細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成,脂肪酸氧化以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝。5.與單獨(dú)衣霉素處理相比,LY294002、NVP-BEZ235、Rapamycin分別和衣霉素共同處理細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)的TG含量降低,胞外TG含量差異不顯著,胞內(nèi)VLDL含量增加,油紅O染色顯示細(xì)胞內(nèi)脂滴顆粒明顯減少；基因ACCa、FAS、SREBP-1、 CPT1、ACOX1、MTP、ApoB、PPARy和DGAT2的mRNA表達(dá)量降低,PPARα、DGAT1表達(dá)量增加；CPT1、MTP蛋白濃度升高,ACC蛋白濃度降低(P0.05),FAS蛋白濃度差異不顯著；western blotting結(jié)果表明CPT1蛋白表達(dá)降低；以上結(jié)果表明當(dāng)通路被抑制時,能有效緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對脂質(zhì)代謝過程的影響。
【關(guān)鍵詞】：鵝原肝代細(xì)胞 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 PI3K-Akt-mTOR通路 脂質(zhì)代謝
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S835
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 1. 文獻(xiàn)綜述14-23
• 1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的信號通路14-17
• 1.1.1 ATF6途徑15-16
• 1.1.2 IRE1/XBP1途徑16
• 1.1.3 PERK/eIF2a途徑16-17
• 1.2 衣霉素與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激17
• 1.2.1 蛋白質(zhì)的糖基化17
• 1.2.2 衣霉素與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激17
• 1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與脂質(zhì)代謝的關(guān)系17-21
• 1.3.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激直接激活SREBPs18
• 1.3.2 IRE1與脂質(zhì)代謝18-19
• 1.3.3 ATF6與脂質(zhì)代謝19
• 1.3.4 PERK與脂質(zhì)代謝19-20
• 1.3.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通過影響ApoB調(diào)節(jié)脂類的分泌20-21
• 1.4 PI3K-Akt-mTOR信號途徑與脂質(zhì)代謝的關(guān)系21-22
• 1.5 PI3K-Akt-mTOR信號途徑與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相互作用22-23
• 1.6 本研究的目的及意義23
• 2. 材料與方法23-35
• 2.1 試驗(yàn)材料23-26
• 2.1.1 試驗(yàn)樣品23
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備23-24
• 2.1.3 主要藥品和試劑24-26
• 2.2 試驗(yàn)方法26-35
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成26-27
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)27-28
• 2.2.3 LY294002、NVP-BEZ235、Rapamycin和TM處理細(xì)胞28-29
• 2.2.4 CCK-8檢測細(xì)胞活性29
• 2.2.5 脂滴油紅O染色29
• 2.2.6 總RNA提取及質(zhì)量檢測29-30
• 2.2.7 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30-31
• 2.2.8 熒光定量PCR31-32
• 2.2.9 蛋白質(zhì)抽提32-33
• 2.2.10 酶活檢測33-34
• 2.2.11 Western blot34-35
• 2.2.12 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析35
• 3. 結(jié)果與分析35-49
• 3.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對脂質(zhì)代謝的影響研究35-39
• 3.1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑的篩選35-37
• 3.1.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑對脂質(zhì)代謝的影響37-39
• 3.2 PI3K-Akt-mTOR信號途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相互影響39-44
• 3.2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對PI3K-Akt-mTOR信號途徑的影響39-40
• 3.2.2 PI3K-Akt-mTOR信號途徑抑制劑對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響40-41
• 3.2.3 PI3K-Akt-mTOR信號途徑抑制劑與衣霉素共同處理對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響41-44
• 3.3 PI3K-Akt-mTOR信號途徑與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激共同調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的研究44-49
• 3.3.1 PI3-Akt-mTOR信號途徑抑制劑與衣霉素共同處理對脂肪酸合成的影響3144-45
• 3.3.2 PI3K-Akt-mTOR信號途徑抑制劑與衣霉素共同處理對脂肪酸氧化的影響45-46
• 3.3.3 PI3K-Akt-mTOR信號途徑抑制劑與衣霉素共同處理對脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響46-49
• 4. 討論49-55
• 4.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與PI3K-Akt-mTOR信號途徑的關(guān)系49-51
• 4.1.1 PI3K-Akt對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響49-50
• 4.1.2 mTOR對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響50-51
• 4.1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對PI3K-Akt-mTOR信號通路的影響51
• 4.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對脂質(zhì)代謝的調(diào)控51-53
• 4.2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對脂質(zhì)合成的調(diào)控51-52
• 4.2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對脂質(zhì)氧化的調(diào)控52
• 4.2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控52-53
• 4.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過PI3K-Akt-mTOR信號途徑對脂質(zhì)代謝的調(diào)控53-55
• 4.3.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過PI3K-Akt-mTOR途徑調(diào)控脂質(zhì)合成和氧化53-54
• 4.3.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過PI3K-Akt-mTOR信號途徑對脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控54-55
• 5. 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-64
• 致謝64-65
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄65

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 劉佳;李傳飛;寧波;楊朝霞;;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過SCAP/SREBP-1c調(diào)控L02肝細(xì)胞脂質(zhì)合成代謝[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2015年05期

2 皮振鈞;李斌;劉俊科;易平;黃思羅;;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝細(xì)胞脂類代謝[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年23期

3 李萍;馬博清;陳金虎;劉晶;;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與胰島素抵抗[J];河北醫(yī)藥;2012年24期

4 莊娟;;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[J];生物學(xué)教學(xué);2012年12期

5 敖娜;楊晶;都健;;體外誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的常用方法和機(jī)制探討[J];醫(yī)學(xué)綜述;2012年22期

6 嚴(yán)冬梅;鄧?yán)?張春燕;段春燕;;PI3K/Akt抑制劑對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下肝癌細(xì)胞MEK/ERK途徑的影響[J];瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2012年02期

7 王洪巖;劉曉s，

本文編號：674043