本文關(guān)鍵詞：青藏高原土壤中產(chǎn)植酸酵微生物的篩選及酶學(xué)特性研究

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【摘要】：植酸酶是一類催化植酸鹽水解為無機磷酸鹽和肌醇的酶類,作為一種新型飼料添加劑,在動物營養(yǎng)及環(huán)境保護等領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。在單胃動物飼料中加入微生物源植酸酶不僅能有效提高磷的利用率,降低磷對環(huán)境污染,而且可解除植酸對飼料中營養(yǎng)因子螯合作用,提升飼料的營養(yǎng)價值,因而在國內(nèi)外受到廣泛關(guān)注。本研究對青藏高原地區(qū)土壤中產(chǎn)植酸酶微生物進行分離篩選,誘變選育,獲得高產(chǎn)植酸酶菌株,并對其產(chǎn)植酸酶的性質(zhì)進行了研究,取得了如下主要研究結(jié)果。1、從青藏高原土壤中共分離得到18株產(chǎn)植酸酶菌株,分別來自三種不同的生境,其中柴達(dá)木盆地灌叢沙丘根際分離得到10株(占55.5%),青藏高原沙化草原分離得到3株(占16.7%),青藏高原鐵路沿線5株(27.8%),其它沙化地且植被較少的取樣地未分離得到植酸降解菌。通過16s/18s rRNA基因序列分析方法對18株菌進行鑒定,其中Erwinia persicina AT1-1,Fusarium tricinctum BLH-2,Talaromyces pinophilus NMH 2-1-1,Cladosporium cladosporioides NMH 3-3-2菌株是首次發(fā)現(xiàn)植酸降解菌。對18株菌酶活的研究發(fā)現(xiàn)Penicillium glabrum NMH 2-3-1產(chǎn)植酸酶活性最高(2695.3 U/mL)。2、在28℃、160 r/min條件下對菌株P(guān)enicillium glabrum NMH 2-3-1進行搖瓶培養(yǎng),培養(yǎng)6d后,對所產(chǎn)植酸酶進行了純化和酶學(xué)性質(zhì)研究,結(jié)果表明該酶在pH 4.0~8.0和20~60℃性質(zhì)穩(wěn)定,最適反應(yīng)溫度為55℃,60℃保溫1h,酶活保持在75%,具有較好的熱穩(wěn)定性。Mn~(2+)、Cu~(2+)、Al~(3+)對該酶活具顯著抑制作用,Ca~(2+)、Mg~(2+)顯著提高該酶的活性。該酶具有較好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解能力。3、對Penicillium glabrum strain NMH 2-3-1進行了紫外線誘變選育,得到4株高產(chǎn)植酸酶的菌株,分別命名為P.glabrum U1、P.glabrum U2、P.glabrum U3、P.glabrum U4,其中P.glabrum U3產(chǎn)植酸酶酶活最高,達(dá)到3611.3 U/mL,較出發(fā)菌株提高34%。通過甲基磺酸乙酯(EMS)對P.glabrum U3株菌進行再次誘變,通過復(fù)篩,最終得到4株高產(chǎn)菌株,其中P.glabrum E1酶活比P.glabrum U3提高8.9%,達(dá)到4014.9 U/m L,較原始出發(fā)菌株提高了近49%。對P.glabrum E1連續(xù)傳代培養(yǎng),產(chǎn)酶性能基本穩(wěn)定。4、通過Plackett-Burman實驗設(shè)計對發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明,培養(yǎng)液中NH4NO3、MnSO4、FeSO4的濃度是影響植酸酶酶活的顯著因素。利用Box-Behnken設(shè)計進行了3因子優(yōu)化設(shè)計,優(yōu)化得到的培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件為:淀粉1.5%、NH_4NO_3 0.375%、Mg_SO_4·7H_2O 0.05%、KCl 0.05%、MnSO_4 0.008%、FeSO_4 0.0078%,pH 6.0,接種量2%,30℃,搖床轉(zhuǎn)速160 r/min。酶活達(dá)4197.15 U/mL,較優(yōu)化前菌株,植酸酶酶活提高了4.9%。5、在37℃條件下,用P.glabrum E1產(chǎn)植酸酶粗提液對麩皮、豆粕、棉粕、玉米粉四種飼料原料植酸磷降解率進行了測定,結(jié)果表明,4種原料的植酸磷含量分別為69.64%、62.82%、61.24%、44.00%,加入酶液3 h后,該植酸酶粗提液對4種飼料原料中植酸磷降解率分別為47.08%、59.95%、62.48%、65.74%,表明該植酸酶對四種原料中的麩皮植酸磷降解效率最好,然后依次是豆粕棉粕玉米粉,對麩皮的降解率要分別比豆粕、棉粕、玉米粉高出8.82%、4.96%、28.38%。
【關(guān)鍵詞】：青藏高原 植酸酶 植酸降解菌 土壤微生物
【學(xué)位授予單位】：蘭州交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S816
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 緒論11-22
• 1.1 植酸酶及其分類11-13
• 1.2 植酸酶來源13-14
• 1.2.1 植物源植酸酶13
• 1.2.2 動物源植酸酶13
• 1.2.3 微生物源植酸酶13-14
• 1.3 提高植酸酶產(chǎn)率的策略14-15
• 1.3.1 菌種的誘變14
• 1.3.2 基因工程菌14-15
• 1.3.3 原生質(zhì)體融合技術(shù)15
• 1.4 植酸酶分離純化技術(shù)15-17
• 1.4.1 預(yù)處理和濃縮15-17
• 1.4.2 層析純化17
• 1.4.3 植酸酶的固定化17
• 1.5 植酸酶的國內(nèi)外市場狀況及其應(yīng)用研究17-20
• 1.5.1 植酸酶的國內(nèi)外市場狀況17-18
• 1.5.2 飼料工業(yè)中的應(yīng)用18-19
• 1.5.3 食品工業(yè)中的應(yīng)用19
• 1.5.4 作為土壤改良劑19
• 1.5.5 促進植物生長中的應(yīng)用19-20
• 1.5.6 其他應(yīng)用領(lǐng)域20
• 1.6 前景與展望20
• 1.7 本文的研究目的及意義20-22
• 2 青藏高原土壤產(chǎn)植酸酶微生物的分離篩選及鑒定22-31
• 2.1 材料與方法22-25
• 2.1.1 土壤樣品的采集22-23
• 2.1.2 培養(yǎng)基23
• 2.1.3 試劑的配制23
• 2.1.4 菌種的分離與篩選23-24
• 2.1.5 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備24
• 2.1.6 植酸酶酶活的測定24
• 2.1.7 產(chǎn)植酸酶微生物的DNA提取24
• 2.1.8 16S rRNA基因序列及 18S rRNA基因序列的PCR擴增與測序24-25
• 2.2 實驗結(jié)果25-31
• 2.2.1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制25-26
• 2.2.2 產(chǎn)植酸酶菌株的篩選26-27
• 2.2.3 產(chǎn)植酸酶菌株的分子鑒定27-31
• 3 植酸酶的純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究31-42
• 3.1 材料與方法31-33
• 3.1.1 試劑31
• 3.1.2 供試飼料原料31
• 3.1.3 實驗儀器31-32
• 3.1.4 產(chǎn)植酸酶微生物的生長曲線及酶活的測定32
• 3.1.5 植酸酶的初步純化32
• 3.1.6 植酸酶酶學(xué)性質(zhì)研究32-33
• 3.1.7 無機磷含量的測定33
• 3.1.8 飼料原料中總磷含量的測定33
• 3.1.9 植酸磷降解率的測定33
• 3.2 實驗結(jié)果33-42
• 3.2.1 菌株的生長及產(chǎn)酶曲線33-34
• 3.2.2 植酸酶粗提液的硫酸銨分級沉淀34-37
• 3.2.3 植酸酶的最適pH及穩(wěn)定性37
• 3.2.4 植酸酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性37-38
• 3.2.5 金屬離子對植酸酶酶活的影響38-39
• 3.2.6 胰蛋白酶和胃蛋白酶對植酸酶酶活的影響39
• 3.2.7 樣品原料中磷含量分析39-40
• 3.2.8 原料中植酸磷降解效率分析40-42
• 4 菌株P(guān)enicillium glabrum的復(fù)合誘變42-48
• 4.1 材料與方法42-43
• 4.1.1 誘變菌株42
• 4.1.2 培養(yǎng)基42
• 4.1.3 主要試劑42
• 4.1.4 誘變方法42-43
• 4.2 實驗結(jié)果43-48
• 4.2.1 P. glabrum的紫外誘變43
• 4.2.2 P. glabrum的EMS誘變43-44
• 4.2.3 P. glabrum E1的產(chǎn)酶穩(wěn)定性44-45
• 4.2.4 P. glabrum E1的生長曲線及液態(tài)發(fā)酵特征45-48
• 5 菌株P(guān)enicillium glabrum E1產(chǎn)植酸酶發(fā)酵工藝優(yōu)化48-58
• 5.1 材料與方法48-50
• 5.1.1 菌株48
• 5.1.2 培養(yǎng)基48
• 5.1.3 培養(yǎng)基實驗方法48-50
• 5.2 實驗結(jié)果50-58
• 5.2.1 單因素實驗50-51
• 5.2.2 Plackett-Burman試驗優(yōu)化51-53
• 5.2.3 Box-Behnken試驗優(yōu)化53-55
• 5.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化及分析55-58
• 6 討論與結(jié)論58-63
• 致謝63-64
• 參考文獻(xiàn)64-73
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果與參與項目73

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王凱;張威;李師翁;;植酸酶及其應(yīng)用[J];中國生物工程雜志;2015年09期

2 侯文通;楊俐蘋;白由路;代明;陳日遠(yuǎn);李新柱;胡兆平;;轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米提高土壤磷素有效性初步研究[J];土壤通報;2014年03期

3 王成波;;植酸酶固定化條件的研究[J];黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年05期

4 蘇毅;杜文雅;李曉曉;黃世江;劉麗麗;;植酸酶生物肥料對農(nóng)作物生長的促進作用[J];天津師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2014年01期

5 朱啟忠;李玉婷;王文君;;一株新型飼料用酶菌株的篩選及發(fā)酵條件研究[J];資源開發(fā)與市場;2013年05期

6 鮑振國;孫新文;張彪;張文舉;;產(chǎn)植酸酶枯草芽孢桿菌誘變選育方法的研究[J];飼料研究;2013年04期

7 何海燕;張健;覃擁靈;;米曲霉A-1植酸酶快速純化及酶學(xué)性質(zhì)[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年01期

8 王陶;李文;尹龍;劉洋;;紫外-氯化鋰復(fù)合誘變選育中性植酸酶高產(chǎn)菌株[J];食品科學(xué);2012年13期

9 管海華;賈秉晟;王家芳;何瑤;楊啟銀;;一株產(chǎn)纖維素酶和植酸酶的米曲霉的誘變篩選和固體發(fā)酵[J];南京師大學(xué)報(自然科學(xué)版);2011年02期

10 孫臨泉;陳子學(xué);張洪立;劉冰;劉麗麗;;微生物植酸酶對土壤有機磷組分含量及有效性的影響[J];天津師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2011年02期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 龍元;重組耐熱植酸酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究[D];同濟大學(xué);2007年

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本文編號：666331