本文關(guān)鍵詞：深度測序法篩選和鑒定維持奶山羊雄性生殖干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵因子

  更多相關(guān)文章： 轉(zhuǎn)錄組 精原干細(xì)胞 Pax7 自我更新 奶山羊

【摘要】：精原干細(xì)胞(Spermatogonial Stem Cells,SSCs),也稱為雄性生殖干細(xì)胞,是位于睪丸組織曲細(xì)精管基基底膜上的一種成體干細(xì)胞,雄性生殖干細(xì)胞通過自我復(fù)制維持自身群體數(shù)量的穩(wěn)定,又可發(fā)育分化成可遺傳的配子-精子。SSCs是研究精子發(fā)生、減數(shù)分裂的分子調(diào)控和細(xì)胞重編程的一個理想的體外模型。雄性生殖干細(xì)胞作為精子發(fā)生過程中的起源性細(xì)胞,其本身具有維持自我更新和分化的雙重性能,該種干細(xì)胞中存在復(fù)雜而又精密的調(diào)控機(jī)制。SSCs中存在的這一復(fù)雜而又龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)必然也伴隨著大量的調(diào)控因子,包括coding-RNA水平的基因,轉(zhuǎn)錄因子以及nocoding-RNA水平的miRNA,siRNA和lncRNA。為宏觀整體地了解SSCs中可能存在的維持干性的調(diào)控因子,常規(guī)的試驗(yàn)驗(yàn)證方法已經(jīng)不能夠達(dá)到驗(yàn)證目的,隨著DNA測序技術(shù)的飛速發(fā)展,第二代測序技術(shù)能夠一次性完成DNA分子序列測定通量高達(dá)幾十萬到幾百萬條。使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能。本研究將基于奶山羊這一物種對維持雄性生殖干細(xì)胞的自我更新相關(guān)因子進(jìn)行篩選、鑒定及其作用機(jī)理的分析研究。已有報道Pax7可以作為小鼠睪丸中少量細(xì)胞群所表達(dá)的特異、全新的細(xì)胞標(biāo)記,被相繼應(yīng)用到人類、靈長類等其他物種上。本實(shí)驗(yàn)通過Hiseq2000高通量測序平臺對了奶山羊CD49f陰、陽性睪丸細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜進(jìn)行測序,分析兩類細(xì)胞中精原干細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)特征。之后試驗(yàn)鑒定分選出的CD49f陽性睪丸細(xì)胞是奶山羊的精原干細(xì)胞群;并進(jìn)一步從個體、細(xì)胞和分子水平研究了候選基因Pax7對奶山羊雄性生殖干細(xì)胞自我更新功能和細(xì)胞增殖的影響。1.奶山羊精原細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜利用免疫磁珠分選法和Hiseq2000深度測序分析技術(shù)獲得了CD49f陰、陽性睪丸細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜,CD49f陰、陽性精原細(xì)胞中共同表達(dá)的有28880條基因,確定了574個在CD49f陽性睪丸細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)2倍的基因和1426個在CD49f陰性睪丸細(xì)胞中上調(diào)2倍的基因。GO分析可得,1026(54%)個差異基因富集歸類到“精子發(fā)生”(GO:0007283),有58個基因?qū)儆谠揋O項(xiàng)目下。分組分析表達(dá)量上下調(diào)的差異基因,發(fā)現(xiàn)在pathway通路分析中,CD49f陰性組表達(dá)量較高的基因能夠富集到“Oocyte meiosis”(PATH:04114)通路上。2.Pax7基因在奶山羊睪丸中的功能作用利用QRT-PCR技術(shù)檢測Pax7基因在奶山羊睪丸組織中表達(dá)規(guī)律,發(fā)現(xiàn)隨年齡的增長,Pax7基因在逐漸減少。免疫熒光切片染色發(fā)現(xiàn),Pax7基因特異的表達(dá)在曲細(xì)精管基底膜上的精原干細(xì)胞,但只有少量可著色,因此可將Pax7作為奶山羊早期精原干細(xì)胞的標(biāo)記。利用NCBI數(shù)據(jù)庫,通過電子克隆的方法獲得奶山羊的Pax7全長序列并構(gòu)建過表達(dá)載體pPax7-mCherry-N1。在mGSCs中過表達(dá)Pax7,結(jié)合QRT-PCR、免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測mGSCs中與自我更新與分化相關(guān)基因的變化情況,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Pax7組的細(xì)胞能較好的維持自我更新相關(guān)的基因PLZF、GFRa1、ID4、OCT4的表達(dá),Pax7基因在奶山羊精原干細(xì)胞中過量表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平促進(jìn)PLZF,ID4,OCT4等多能性和自我更新相關(guān)基因的表達(dá),可在一定水平上促進(jìn)自我更新能力的維持。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)錄組 精原干細(xì)胞 Pax7 自我更新 奶山羊
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S827
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 文獻(xiàn)綜述12-21
• 第一章 雄性生殖干細(xì)胞自我更新功能的研究進(jìn)展12-21
• 1.1 雄性生殖干細(xì)胞12-17
• 1.1.1 雄性生殖干細(xì)胞的來源12-14
• 1.1.2 雄性生殖干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記14-16
• 1.1.3 雄性生殖干細(xì)胞相關(guān)通路研究16
• 1.1.4 基于高通量測序的雄性生殖干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究16-17
• 1.2 Pax7研究進(jìn)展17-20
• 1.2.1 Pax7結(jié)構(gòu)特征18
• 1.2.2 Pax7的功能研究18-20
• 1.3 存在的問題及展望20-21
• 試驗(yàn)研究21-46
• 第二章 奶山羊雄性生殖干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組比對分析21-28
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器21
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物和主要試劑21
• 2.1.2 主要儀器21
• 2.2 試驗(yàn)方法21-23
• 2.2.1 主要溶液配制21-22
• 2.2.2 奶山羊精原細(xì)胞的分離和免疫磁珠法分選22-23
• 2.2.3 奶山羊轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建及測序23
• 2.2.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計23
• 2.3 結(jié)果23-26
• 2.3.1 奶山羊CD49f陰、陽性精原細(xì)胞分選及檢測23-24
• 2.3.2 奶山羊CD49f陰、陽性精原細(xì)胞測序結(jié)果評估24-25
• 2.3.3 Unigene物種注釋分析25-26
• 2.4 討論26-27
• 2.5 小結(jié)27-28
• 第三章 奶山羊精原干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組差異基因比較28-38
• 3.1 試驗(yàn)方法28-30
• 3.1.1 生物信息學(xué)分析主要數(shù)據(jù)庫28
• 3.1.2 基因的差異表達(dá)分析28-29
• 3.1.3 GO聚類分析29-30
• 3.1.4 KEGG分析30
• 3.1.5 候選基因的功能富集分析30
• 3.1.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理30
• 3.2 結(jié)果30-37
• 3.2.1 奶山羊CD49f陰陽性精原細(xì)胞差異表達(dá)基因30-33
• 3.2.2 GO功能顯著性分析33
• 3.2.3 代謝通路顯著性分析33-37
• 3.3. 討論37
• 3.4. 小結(jié)37-38
• 第四章 PAX7維持奶山羊雄性生殖干細(xì)胞的自我更新38-46
• 4.1 材料38-39
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料38
• 4.1.2 主要試劑38-39
• 4.1.3 主要儀器設(shè)備及耗材39
• 4.2 方法39-40
• 4.2.1 主要溶液配制39
• 4.2.2 Pax7基因的克隆39
• 4.2.3 Pax7在奶山羊睪丸組織中表達(dá)情況檢測39-40
• 4.2.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理40
• 4.3 結(jié)果40-45
• 4.3.1 Pax7在奶山羊體內(nèi)表達(dá)情況40-41
• 4.3.2 奶山羊Pax7基因鑒定及功能特性鑒定41-42
• 4.3.3 奶山羊Pax7基因功能分析42-45
• 4.4 討論45
• 4.5 小結(jié)45-46
• 結(jié)論46
• 創(chuàng)新點(diǎn)46
• 進(jìn)一步研究課題46-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 附錄53-56
• 縮略詞56-57
• 致謝57-58
• 作者簡介58

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