本文關(guān)鍵詞：甘氨酰tRNA合成酶對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳合成及細(xì)胞增殖的影響

  更多相關(guān)文章： 奶牛乳腺上皮細(xì)胞 甘氨酰tRNA合成酶 乳合成 細(xì)胞增殖

【摘要】：隨著人們對(duì)食品安全認(rèn)識(shí)的不斷加深,使得乳品質(zhì)的好壞和產(chǎn)奶量的高低得到更廣泛的關(guān)注。研究泌乳相關(guān)信號(hào)通路,探尋與泌乳相關(guān)的重要調(diào)控分子,有利于為奶牛乳品質(zhì)和乳產(chǎn)量的提高,提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及新途徑。甘氨酰tRNA合成酶(glycyl-t RNA synthetase,GlyRS)是重要的氨基酰tRNA合成酶(aminoacyl-t RNA synthetases,aa RSs)家族成員。研究發(fā)現(xiàn)aa RSs存在多種經(jīng)典翻譯功能之外的信號(hào)調(diào)控作用。但是,目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于GlyRS在奶牛乳腺發(fā)育過(guò)程中表達(dá)及調(diào)節(jié)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)GlyRS與BMECs乳蛋白的合成有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)旨在闡明GlyRS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)乳蛋白、乳脂、乳糖以及細(xì)胞增殖的影響。從而初步揭示GlyRS是一個(gè)新的調(diào)節(jié)BMECs乳合成的信號(hào)分子。本研究采用了組織塊培養(yǎng)法,體外培養(yǎng)并得到了純化的BMECs。利用免疫熒光(immunofluorescence,IF)和蛋白質(zhì)免疫印記(western blotting,WB)檢測(cè)細(xì)胞中角蛋18(CK18)和β-Casein(CSN2)的表達(dá),以鑒定細(xì)胞的純度和泌乳功能。實(shí)驗(yàn)通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加0.6mmol/L的蛋氨酸(methionine,Met)或10%的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)建立一個(gè)體外細(xì)胞培養(yǎng)的泌乳模型。采用WB、IF以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)等方法,檢測(cè)添加Met或FBS后,乳糖和乳脂(triglyceride,TG)的分泌量,DNA數(shù)量,CSN2、GlyRS、p-GlyRS(T544,S704)的表達(dá)量以及p-GlyRS(T544,S704)的定位情況。結(jié)果表明,添加Met或FBS可以促進(jìn)細(xì)胞乳糖和乳脂的分泌(p0.05),增加DNA合成,顯著提高CSN2、GlyRS以及p-GlyRS(T544,S704)的表達(dá)量(p0.05),同時(shí)發(fā)現(xiàn)p-GlyRS(T544,S704)在細(xì)胞核中定位明顯增加。這表明,在Met或FBS可以通過(guò)GlyRS調(diào)節(jié)BMECs乳合成以及細(xì)胞增殖。利用純化后的BMECs分別建立GlyRS過(guò)表達(dá)(pGCMV-IRES-EGFP-GlyRS)與干擾(GlyRS shRNA)的細(xì)胞泌乳模型,采用WB、IF、qRT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)等方法,檢測(cè)乳糖和乳脂的分泌量,DNA數(shù)量,細(xì)胞周期的分布以及GlyRS、p-GlyRS(T544)、p-GlyRS(S704)、mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1、SREBP-1、CSN2、Cyclin D1和β-1,4-galactosyltransferase2(β4Gal-T2)的表達(dá)。結(jié)果表明,當(dāng)GlyRS過(guò)表達(dá)和抑制時(shí),乳糖和乳脂的分泌量,細(xì)胞的DNA合成,處于S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)分別顯著增加和降低(p0.05)。同時(shí),GlyRS、p-GlyRS(T544)、p-Gly RS(S704)、p-mTOR、p-S6K1、SREBP-1、Cyclin D1和CSN2的蛋白表達(dá)水平以及β4Gal-T2的mRNA表達(dá)量也均顯著增加和降低(p0.05)。然而,mTOR和S6K1的蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化(p0.05)。這表明,GlyRS通過(guò)上調(diào)p-GlyRS(T544)、p-GlyRS(S704)、p-mTOR、p-S6K1、SREBP-1、Cyclin D1以及β4Gal-T2的表達(dá)量,促進(jìn)乳蛋白、乳脂以及乳糖的合成,同時(shí)提高BMECs增殖能力。綜上所述,GlyRS作為一個(gè)重要的信號(hào)分子,能接受營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如Met,FBS)信號(hào),正向調(diào)節(jié)BMECs的乳合成以及細(xì)胞增殖。其可能的調(diào)控機(jī)制如下:當(dāng)GlyRS接受Met或FBS刺激后,其磷酸化蛋白水平增加,進(jìn)入細(xì)胞核量增多,通過(guò)上調(diào)p-mTOR、p-S6K1、SREBP-1、β4Gal-T2以及Cyclin D1的表達(dá),促進(jìn)BMECs乳合成以及細(xì)胞增殖。
【關(guān)鍵詞】：奶牛乳腺上皮細(xì)胞 甘氨酰tRNA合成酶 乳合成 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823
【目錄】：

• 摘要10-12
• 英文摘要12-14
• 1 引言14-22
• 1.1 乳腺上皮細(xì)胞乳合成和細(xì)胞增殖的基本規(guī)律14-15
• 1.1.1 乳蛋白的合成14
• 1.1.2 乳脂合成14
• 1.1.3 乳糖合成14-15
• 1.1.4 MECs的增殖15
• 1.2 調(diào)控BMECs乳合成的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑15-19
• 1.2.1 mTOR途徑對(duì)乳蛋白和乳脂合成的調(diào)控15-16
• 1.2.2 SREBP-1 途徑對(duì)乳脂合成的調(diào)控16-17
• 1.2.3 β4GalT對(duì)乳糖合成的調(diào)控17
• 1.2.4 Cyclin D1對(duì)MECs增殖的調(diào)控17
• 1.2.5 外源激素、生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)素對(duì)乳合成和細(xì)胞增殖的調(diào)控17-19
• 1.3 氨基酰tRNA合成酶19-20
• 1.3.1 氨基酰tRNA合成酶的基本結(jié)構(gòu)19
• 1.3.2 aaRSs的非經(jīng)典功能19-20
• 1.3.3 甘氨酰tRNA合成酶的非經(jīng)典功能20
• 1.4 實(shí)驗(yàn)的目的與意義20-22
• 2 材料與方法22-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-25
• 2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑22-23
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器23
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞23-24
• 2.1.4 試劑的配制24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟25-35
• 2.2.1 BMECs的原代培養(yǎng)與純化25-26
• 2.2.2 BMECs的鑒定26-28
• 2.2.3 添加Met、FBS的BMECs泌乳模型的建立28
• 2.2.4 過(guò)表達(dá)GlyRS的BMECs泌乳模型的建立28-29
• 2.2.5 抑制GlyRS的BMECs泌乳模型的建立29-32
• 2.2.6 添加Met、FBS后對(duì)BMECs乳合成以及細(xì)胞增殖的影響32-33
• 2.2.7 GlyRS過(guò)表達(dá)后對(duì)BMECs乳合成以及細(xì)胞增殖的影響33-34
• 2.2.8 GlyRS抑制后對(duì)BMECs乳合成以及細(xì)胞增殖的影響34
• 2.2.9 數(shù)據(jù)處理34-35
• 3 結(jié)果與分析35-54
• 3.1 BMECs的原代培養(yǎng)35-36
• 3.2 加Met、FBS后對(duì)BMECs乳合成以及細(xì)胞增殖的影響36-42
• 3.2.1 加Met、FBS后對(duì)BMECs乳糖分泌的影響36-37
• 3.2.2 加Met、FBS后對(duì)BMECs TG分泌的影響37-38
• 3.2.3 加Met、FBS后對(duì)BMECs增殖的影響38-39
• 3.2.4 Met、FBS調(diào)節(jié)BMECs中相關(guān)基因的表達(dá)39-40
• 3.2.5 加Met、FBS后對(duì)p-GlyRS核定位的影響40-42
• 3.3 GlyRS過(guò)表達(dá)后可上調(diào)BMECs的乳合成及細(xì)胞增殖42-46
• 3.3.1 GlyRS過(guò)表達(dá)后增加BMECs乳糖的分泌42
• 3.3.2 GlyRS過(guò)表達(dá)后增加BMECsTG的分泌42-43
• 3.3.3 GlyRS過(guò)表達(dá)后促進(jìn)DNA合成及加快細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換43-45
• 3.3.4 GlyRS過(guò)表達(dá)后增加β4Gal-T2的mRNA表達(dá)量45
• 3.3.5 GlyRS過(guò)表達(dá)后增加相關(guān)蛋白的表達(dá)45-46
• 3.4 GlyRS抑制后可下調(diào)BMECs的乳合成及細(xì)胞增殖46-54
• 3.4.1 GlyRS干擾片段的篩選46-48
• 3.4.2 GlyRS抑制后減少BMECs乳糖的分泌48-49
• 3.4.3 GlyRS抑制后減少BMECs 中TG的分泌49-50
• 3.4.4 GlyRS抑制后減少DNA合成及減緩細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換50-52
• 3.4.5 GlyRS抑制后降低β4Gal-T2的mRNA表達(dá)量52
• 3.4.6 GlyRS抑制后降低相關(guān)蛋白水平的表達(dá)52-54
• 4 討論54-59
• 4.1 BMECs的原代培養(yǎng)、純化及鑒定54
• 4.2 Met和FBS對(duì)BMECs乳合成及細(xì)胞增殖的影響54-56
• 4.2.1 Met和FBS對(duì)乳蛋白、乳脂及乳糖合成的影響54-55
• 4.2.2 Met和FBS對(duì)BMECs增殖能力的影響55
• 4.2.3 Met和FBS對(duì)GlyRS表達(dá)的影響55
• 4.2.4 Met和FBS對(duì)p-GlyRS表達(dá)及入核的影響55-56
• 4.3 GlyRS對(duì)BMECs乳合成以及細(xì)胞增殖的影響56-59
• 4.3.1 GlyRS對(duì)BMECs乳蛋白合成的影響56
• 4.3.2 GlyRS對(duì)BMECs乳脂合成的影響56
• 4.3.3 GlyRS對(duì)BMECs乳糖合成的影響56-57
• 4.3.4 GlyRS過(guò)表達(dá)與抑制對(duì)p-GlyRS表達(dá)的影響57
• 4.3.5 GlyRS對(duì)細(xì)胞增殖的影響57-59
• 5 結(jié)論59-60
• 致謝60-61
• 參考文獻(xiàn)61-68
• 附錄68-70
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文70

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 陸玲,黃為一,袁生,樊慶笙;鈣在粟酒裂殖酵母細(xì)胞增殖過(guò)程中的效應(yīng)[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年02期

2 闞飛;孫捷;田路e，

本文編號(hào)：656127