本文關(guān)鍵詞：雞TAP1基因多態(tài)性及其在先天免疫中mRNA表達規(guī)律研究

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【摘要】：我國是養(yǎng)禽大國且產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,而疾病是限制養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個重要因素。長期以來,疾病的控制主要依賴疫苗,由于病原微生物的變異及毒力的不斷增強等原因,使得疫苗使用效果不斷下降。因此,研究者開始轉(zhuǎn)向抗病育種研究,期望能從遺傳上提高家禽的抗病能力。研究表明,在家禽中MHC(major histocompatibility complex,主要組織相容性復合體)基因與多種疾病的抗性存在高度相關(guān)性,是家禽抗病育種研究中的優(yōu)選標記基因。在雞上,位于MHC基因核心位置的TAP1基因(Transporter associated antigen processing,抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運體),是編碼一類在內(nèi)源性抗原的呈遞過程中起著重要作用的轉(zhuǎn)運蛋白的基因,與抗病性、先天免疫應答及經(jīng)濟性狀間具有相關(guān)性。本研究以29個中國地方雞種和國外雞種為研究對象,研究不同雞種TAP1基因多態(tài)性,對這些雞種進行單倍型判定;并對廣西黃雞感染腸炎沙門氏菌后的TAP1表達量變化及不同單倍型個體TAP1表達規(guī)律進行研究,主要結(jié)果如下：1.為了研究TAP1基因的多態(tài)性,本研究選取國內(nèi)外29個雞種,每個雞種以10個個體的DNA混池對TAP1基因進行目標捕獲測序,測序結(jié)果與NCBI中參考序列(登錄號：427727)比較后發(fā)現(xiàn)：在TAP1基因外顯子上,青腳麻雞是存在SNP最多的品種,文昌雞只存在1個SNP,而如皋黃雞,雪山雞和太湖雞不存在SNP。同時,研究發(fā)現(xiàn)國外雞種,如羅斯雞,隱性白羽雞,安卡雞和AA雞的TAP1基因SNP突變數(shù)量較地方雞種少；國外品種的INDEL突變也相對較少。在TAP1基因內(nèi)含子上,烏骨雞、SPF雞、雪山雞、藏雞和雜交雞所含SNP數(shù)量較多,廣西黃雞和綠殼蛋雞所含INDEL數(shù)量較多；國內(nèi)外品種比較發(fā)現(xiàn),國外雞種所含突變數(shù)量亦較國內(nèi)地方品種少。在TAP1基因啟動子上,在斗雞、固始雞、蕭山雞、鹿苑雞和斗雞雜交品種在67309位置存在10 bp的缺失,而綠殼蛋雞在此出現(xiàn)了20 bp缺失,出現(xiàn)缺失突變的均為國內(nèi)地方品種。以上結(jié)果表明我國地方雞種TAP1基因在外顯子和啟動子區(qū)具有豐富的遺傳多樣性,TAP1基因可作為先天免疫研究的候選基因。2.根據(jù)TAP1基因啟動子多態(tài)性重點對廣西黃雞進行不同單倍型篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAP1基因啟動子同樣存在1個10 bp的缺失,廣西黃雞中存在AA、AB和BB 3種基因型；野生等位基因(與參考序列中紅色原雞一致)與突變等位基因頻率分別為0.847、0.153,PIC為0.239,平均雜合度為0.278,經(jīng)卡方適合性檢驗,廣西黃雞群體中TAP1基因處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。經(jīng)JASPAR數(shù)據(jù)庫預測,TAP1基因啟動子lObp缺失區(qū)域可能存在3個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。3.1日齡廣西黃雞感染腸炎沙門氏菌后0-21 dpi(day-post-infection)盲腸載菌量結(jié)果表明,攻毒組沙門氏菌載菌量5 d最高,2 h到5 d載菌量逐漸升高,5 d到21 d逐漸降低。血漿中細胞因子水平變化結(jié)果表明,對照組與攻毒組細胞因子濃度峰值出現(xiàn)時間點不同。IL-1α、IFN-γ濃度在對照組都是在24 h達到最大值,而攻毒組則是4 h時最大值。ⅠgY濃度在對照組24 h達到第一個峰值,在攻毒組則持續(xù)緩慢上升。ⅠgM濃度在對照組變化不明顯,在攻毒組,細胞因子ⅠgM濃度在2 h快速升高到最大值,2 h到4 h濃度又快速下降,4 h之后濃度緩慢下降；表明廣西黃雞早期免疫反應迅速,2 h-4 h屬于急性反應期,5 d后屬于免疫相對穩(wěn)定期。4.通過QRT-PCR方法檢測1日齡廣西黃雞感染腸炎沙門氏菌后0-21 dpi TAP1基因mRNA表達水平變化,結(jié)果表明,TAP1在心臟、肝臟、胸腺、法氏囊四個不同組織中廣泛表達,但胸腺和法氏囊中整體表達量顯著高于其他組織(P0.05)。感染組和對照組TAP1基因表達量,感染組基因顯著表達高于對照組(P0.05)。對照組TAP1基因表達量隨日齡增加而增加,在3 dpi的表達量顯著升高,表明3 d是免疫狀態(tài)切換的關(guān)鍵時期。對于不同感染時間TAP1表達水平比較,不同組織在3 dpi表達量均最高,在1 dpi的表達量顯著升高,3 dpi之后表達量下降,進一步說明沙門氏菌感染后能引起雞只迅速產(chǎn)生免疫反應,且TAP1基因確實參與廣西黃雞的各種免疫反應。5.采用QRT-PCR方法檢測廣西黃雞中突變型和野生型個體的TAP1 mRNA表達水平變化,在對照組中同一組織中,突變型與野生型個體在不同時間點的TAP1表達量差異不顯著(P0.05)。在攻毒組中,突變型與對照組野生型個體TAP1表達量也存在同樣趨勢,表明TAP1啟動子區(qū)在67309位置10 bp的缺失突變對TAP1的mRNA表達并無顯著影響(P0.05),不同單倍型個體間先天免疫性能無顯著差異(P0.05)。
【關(guān)鍵詞】：雞 TAP1 多態(tài)性 沙門氏菌 先天免疫
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S831
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 文獻綜述10-18
• 1 主要組織相容性復合體(MHC)的研究進展10-13
• 1.1 MHC的研究背景10-11
• 1.2 雞的MHC結(jié)構(gòu)、功能和研究現(xiàn)狀11-13
• 2 TAP基因概述及其研究進展13-14
• 3 目標區(qū)域捕獲測序14-15
• 4 實時熒光定量PCR15-16
• 4.1 SYBR Green染料法15
• 4.2 以參照基因作為標準進行相對定量15-16
• 4.3 實驗數(shù)據(jù)分析方法16
• 5 本研究的目的和意義16-18
• 第二章 不同品種雞TAP1基因多態(tài)性分析18-36
• 1 實驗材料18
• 1.1 實驗動物18
• 1.2 主要儀器18
• 1.3 主要試劑18
• 2 實驗方法18-20
• 2.1 樣品采集與處理18-19
• 2.2 目標區(qū)域捕獲測序19
• 2.3 測序數(shù)據(jù)的整理及分析19
• 2.4 測序結(jié)果PCR驗證19-20
• 3 結(jié)果與分析20-34
• 3.1 TAP1基因外顯子多態(tài)性分析20-26
• 3.2 TAP1基因啟動子及內(nèi)含子區(qū)多態(tài)性分析26-32
• 3.3 不同雞品種的SNP比例分析32-33
• 3.4 對目標捕獲測序結(jié)果進行PCR驗證33-34
• 4 討論34-36
• 第三章 廣西黃雞TAP1基因啟動子多態(tài)性分析36-43
• 1 實驗材料36
• 1.1 試驗動物36
• 1.2 實驗儀器36
• 1.3 實驗試劑36
• 2 實驗方法36-39
• 2.1 DNA提取36-37
• 2.2 引物的設計與合成37
• 2.3 PCR反應體系與反應程序37-38
• 2.4 群體遺傳多樣性分析38-39
• 3 結(jié)果與分析39-41
• 3.1 引物擴增效果及測序結(jié)果39-40
• 3.2 TAP1基因啟動子區(qū)遺傳分析40-41
• 3.3 TAP1基因啟動子突變區(qū)轉(zhuǎn)錄因子分析41
• 4 討論41-43
• 第四章 廣西黃雞TAP1基因mRNA表達規(guī)律分析43-60
• 1 實驗材料43
• 1.1 實驗菌株43
• 1.2 實驗動物43
• 1.3 實驗儀器43
• 1.4 實驗試劑43
• 2 實驗方法43-48
• 2.1 攻毒前菌株的準備和污染檢測43-44
• 2.2 攻毒和樣品采集44
• 2.3 盲腸內(nèi)載菌量檢測44
• 2.4 血漿IL-1α,IFNγ,IgY和IgM濃度檢測44-45
• 2.5 Trizol法提取總RNA及RNA檢測45-46
• 2.6 RNA樣品的反轉(zhuǎn)錄46
• 2.7 引物的設計與合成46-47
• 2.8 熒光定量PCR反應體系及反應程序47-48
• 2.9 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析48
• 3 結(jié)果與分析48-58
• 3.1 沙門氏菌感染后盲腸載菌量變化48-49
• 3.2 沙門氏菌感染后細胞因子水平變化49-51
• 3.3 總RNA的純度與完整性51-52
• 3.4 TAP1基因在對照組不同日齡雛雞中表達規(guī)律52-53
• 3.5 TAP1基因不同攻毒時間不同組織中表達規(guī)律53-54
• 3.6 TAP1基因在攻毒前后表達水平的表達水平差54-57
• 3.7 TAP1基因在野生型和突變型個體的表達差異57-58
• 4 討論58-60
• 全文結(jié)論60-61
• 參考文獻61-66
• 致謝66-67
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄67-68

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本文編號：640293