本文關(guān)鍵詞：豬肺炎支原體烯醇化酶的原核表達(dá)與部分生物學(xué)功能分析

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【摘要】：豬肺炎支原體(Mhp)可導(dǎo)致豬的慢性呼吸道疾病,對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重。病原毒力因子研究將為該病防控提供基礎(chǔ)。本試驗(yàn)對(duì)Mhp烯醇化酶進(jìn)行了原核表達(dá)及功能分析。通過(guò)GenBank查得Mhp烯醇化酶的基因序列,利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)并合成引物,通過(guò)PCR技術(shù)來(lái)擴(kuò)增目的基因,通過(guò)測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)序列中730bp處含有1個(gè)稀有密碼子,隨后我們利用SOE-PCR方法分別對(duì)前段773bp和后段516bp序列進(jìn)行基因擴(kuò)增并連接,將擴(kuò)增到的片段插入到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中,構(gòu)建出重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/Eno。將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/Eno導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá),試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)24h時(shí)目的蛋白的表達(dá)量最高,并用GST Fusion Protein Purification Kit進(jìn)行蛋白純化,得到較純的目的蛋白。Western-blot證實(shí)MhprEno重組蛋白的反應(yīng)原性良好。本試驗(yàn)用純化后的MhprEno重組蛋白免疫BALB/c小鼠,通過(guò)間接ELISA方法檢測(cè),并以純化的MhprEno蛋白作為包被抗原來(lái)檢測(cè)MhprEno蛋白免疫小鼠后的血清中抗體水平。結(jié)果表明,MhprEno蛋白能誘導(dǎo)小鼠使之體內(nèi)產(chǎn)生較高水平的抗體,結(jié)果提示MhprEno蛋白免疫原性比較好。同時(shí),通過(guò)Western-blot和ELISA方法檢測(cè)MhprEno小鼠抗體與不同Mhp菌株的反應(yīng)性。結(jié)果顯示,小鼠抗體與不同菌株均具有良好的反應(yīng)性。用純化好的Eno蛋白進(jìn)行細(xì)胞損傷及黏附試驗(yàn)。結(jié)果顯示,MhprEno蛋白作用16小時(shí)后對(duì)STEC細(xì)胞有劑量依賴(lài)性的損傷,且能抑制Mhp粘附STEC細(xì)胞。綜合以上,本試驗(yàn)構(gòu)建了MhpEno重組表達(dá)菌,并成功獲得了MhprEno蛋白,初步證實(shí)了該蛋白具有抗原反應(yīng)性以及損傷STEC細(xì)胞和抗Mhp黏附細(xì)胞的功能,從而為進(jìn)一步更深入研究探討Mhp的致病機(jī)理及防控方法等提供了必要的理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬肺炎支原體 烯醇化酶 免疫原性
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.62
【目錄】：

• 摘要8-9
• 第一章 文獻(xiàn)綜述9-17
• 1 豬肺炎支原體概述9
• 2 豬肺炎支原體致病機(jī)理及相關(guān)免疫原蛋白的研究9-13
• 2.1 豬肺炎支原體致病機(jī)理概述9
• 2.2 Mhp致病機(jī)理研究進(jìn)展9-11
• 2.2.1 Mhp入侵機(jī)制研究進(jìn)展9-10
• 2.2.2 Mhp損傷及凋亡機(jī)制研究進(jìn)展10-11
• 2.3 豬肺炎支原體毒力相關(guān)因子的研究進(jìn)展11-12
• 2.4 病原與宿主互作研究12-13
• 3 烯醇化酶生物功能研究進(jìn)展13
• 4 烯醇化酶在病原菌方面的研究進(jìn)展13-15
• 5 烯醇化酶在支原體方面研究進(jìn)展15-17
• 第二章 豬肺炎支原體烯醇化酶基因的原核克隆表達(dá)及鑒定17-32
• 1 試驗(yàn)材料17-18
• 1.1 質(zhì)粒和菌株17
• 1.2 主要材料與試劑17
• 1.3 試驗(yàn)儀器17-18
• 2 試驗(yàn)方法18-25
• 2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成18
• 2.2 Mhp168菌液DNA的提取18
• 2.3 Mhp/Eno基因的PCR擴(kuò)增18-19
• 2.4 目的基因的回收及純化19
• 2.5 Mhp Eno基因與pMD18-T載體的連接19-20
• 2.6 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化20
• 2.7 重組質(zhì)粒DNA的提取、鑒定及測(cè)序20-21
• 2.7.1 重組質(zhì)粒的提取20
• 2.7.2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定20
• 2.7.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定20-21
• 2.7.4 重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定21
• 2.8 載體pGEX-4T-1的獲取21
• 2.9 構(gòu)建pGEX-4T-1/Mhp Eno表達(dá)載體21-22
• 2.10 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒DNA的提取及鑒定22
• 2.10.1 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化22
• 2.10.2 重組質(zhì)粒DNA的提取22
• 2.10.3 重組質(zhì)粒的PCR鑒定22
• 2.10.4 重組質(zhì)粒的酶切鑒定22
• 2.10.5 重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定22
• 2.11 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè)22-23
• 2.11.1 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)22
• 2.11.2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)22-23
• 2.11.3 最佳誘導(dǎo)條件的確定23
• 2.11.4 表達(dá)產(chǎn)物的存在狀態(tài)分析23
• 2.12 蛋白的純化23-24
• 2.13 表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot檢測(cè)24-25
• 3 結(jié)果與分析25-30
• 3.1 基因的獲取25
• 3.2 豬肺炎支原體Eno基因的擴(kuò)增結(jié)果25-26
• 3.3 pMD18-T/Eno的雙酶切鑒定結(jié)果26
• 3.4 pMD18-T/Eno的PCR鑒定結(jié)果26-27
• 3.5 pGEX-4T-1/Eno的雙酶切鑒定結(jié)果27
• 3.6 pGEX-4T-1/Eno的PCR鑒定結(jié)果27-28
• 3.7 誘導(dǎo)蛋白的SDS-PAGE結(jié)果28
• 3.8 篩選誘導(dǎo)表達(dá)條件的結(jié)果28-29
• 3.9 純化蛋白的結(jié)果29-30
• 3.10 表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot的鑒定30
• 4 小結(jié)30-32
• 第三章 豬肺炎支原體烯醇化酶的部分生物學(xué)功能分析32-42
• 試驗(yàn)一 Mhp rEno蛋白免疫原性分析32-36
• 1 材料32
• 1.1 儀器32
• 1.2 試驗(yàn)材料及耗材32
• 2 方法32-34
• 2.1 測(cè)定蛋白質(zhì)濃度32
• 2.2 BALB/c小鼠的免疫32-33
• 2.3 間接ELISA方法33
• 2.4 檢測(cè)Mhp rEno蛋白免疫小鼠抗體水平33
• 2.5 鼠抗Mhp rEno血清與不同Mhp菌株反應(yīng)試驗(yàn)33-34
• 2.5.1 制備全菌蛋白33
• 2.5.2 鼠抗Mhp rEno血清與不同菌株蛋白反應(yīng)33-34
• 3 結(jié)果34-36
• 3.1 Mhp rEno蛋白免疫小鼠抗體水平34
• 3.2 不同菌株蛋白反應(yīng)試驗(yàn)34-36
• 試驗(yàn)二 豬肺炎支原體烯醇化酶蛋白對(duì)STEC細(xì)胞的黏附及黏附抑制作用分析36-40
• 1 試驗(yàn)材料36
• 2 試驗(yàn)方法36-38
• 2.1 STEC細(xì)胞膜蛋白的制備36
• 2.2 微孔板檢測(cè)36-37
• 2.3 間接免疫熒光檢測(cè)Mhp rEno蛋白抗Mhp黏附STEC細(xì)胞37
• 2.4 間接免疫熒光檢測(cè)Mhp rEno抗體抗Mhp黏附STEC細(xì)胞37-38
• 3 試驗(yàn)結(jié)果38-40
• 3.1 微孔板黏附試驗(yàn)定量檢測(cè)蛋白黏附能力結(jié)果38
• 3.2 間接免疫熒光檢測(cè)Mhp rEno蛋白抗Mhp黏附STEC細(xì)胞結(jié)果38-39
• 3.3 間接免疫熒光檢測(cè)Mhp rEno抗體抗Mhp黏附STEC細(xì)胞結(jié)果39-40
• 試驗(yàn)三 豬肺炎支原體烯醇化酶蛋白對(duì)STEC細(xì)胞的損傷分析40-42
• 1 試驗(yàn)材料40
• 1.1 細(xì)胞40
• 1.2 主要試劑40
• 1.3 主要儀器40
• 2 試驗(yàn)方法40-41
• 2.1 Mhp rEno蛋白對(duì)STEC細(xì)胞活力的影響40-41
• 2.1.1 STEC細(xì)胞培養(yǎng)40
• 2.1.2 Mhp制備40
• 2.1.3 CCK-8細(xì)胞活力試劑盒測(cè)定不同濃度Mhp rEno對(duì)STEC細(xì)胞的損傷40-41
• 2.1.4 DAPI染色觀(guān)察細(xì)胞損傷的形態(tài)變化41
• 3 試驗(yàn)結(jié)果41-42
• 3.1 CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Mhp rEno蛋白的存在對(duì)STEC細(xì)胞的影響結(jié)果41-42
• 3.2 Mhp rEno蛋白的存在對(duì)STEC細(xì)胞損傷后DAPI染色結(jié)果42
• 總結(jié)42-44
• 討論44-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-52
• Abstract52-54
• 附錄54-56
• 致謝56

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1 張映,任斌知,聶向庭;豬肺炎支原體基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2002年06期

2 祝永琴;劉茂軍;邵國(guó)青;;豬肺炎支原體基因組學(xué)研究進(jìn)展[J];中國(guó)獸醫(yī)雜志;2010年04期

3 韋艷娜;熊祺琰;劉茂軍;馮志新;吳敘蘇;楊莉莉;邵國(guó)青;;不同因素對(duì)豬肺炎支原體顏色變化單位測(cè)定的影響[J];中國(guó)獸藥雜志;2012年08期

4 杜德燕;張洪;姜來(lái)生;方鵬飛;徐靜;;不同容積的培養(yǎng)瓶對(duì)豬肺炎支原體培養(yǎng)滴度的影響[J];四川畜牧獸醫(yī);2013年06期

5 張純萍;沈青春;胡海燕;王芳;徐士新;寧宜寶;高和義;;豬肺炎支原體體外抗菌藥物敏感性試驗(yàn)研究[J];中國(guó)獸藥雜志;2013年04期

6 孔令增;劉艷芬;劉鈾;;廣東豬肺炎支原體的分離與鑒定[J];中國(guó)獸醫(yī)科學(xué);2013年10期

7 劉奎,張順鳳;豬肺炎支原體的培養(yǎng)和保存[J];貴州畜牧獸醫(yī);1995年04期

8 張順鳳，劉奎;豬肺炎支原體的培養(yǎng)和保存[J];生物學(xué)雜志;1996年01期

9 姚睿玉;何啟蓋;周銳;陳煥春;;豬肺炎支原體乳酸脫氫酶基因的克隆、表達(dá)、純化及其間接ELISA檢測(cè)方法的建立[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2007年04期

10 王占偉;熊，

本文編號(hào)：624249