本文關(guān)鍵詞：鼠傷寒沙門氏菌外排泵AcrAB失活對(duì)其它外排泵表達(dá)的影響

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【摘要】：沙門氏菌是一類主要食源性病原菌,在沙門氏菌誘發(fā)感染病例中,鼠傷寒沙門氏菌占很高的分離率。氟喹諾酮類藥作為治療沙門氏菌病的首選藥物被廣泛用于臨床。在氟喹諾酮類選擇壓力下,鼠傷寒沙門氏菌很快對(duì)其產(chǎn)生耐藥,其中最主要的耐藥機(jī)制是增強(qiáng)的外排作用和拓?fù)洚悩?gòu)酶突變。本實(shí)驗(yàn)選取敏感的鼠傷寒沙門氏菌臨床株SH10作為親本菌,建立了pKD46和噬菌體P22介導(dǎo)的基因敲除的方法。為研究AcrAB-TolC及其調(diào)控因子對(duì)SH10敏感性的作用,我們分別構(gòu)建了外排泵和調(diào)控因子的基因缺失株并采用二倍瓊脂稀釋法測(cè)定了缺失株的MIC。結(jié)果顯示,與原菌SH10相比,這些缺失株對(duì)受試的15種抗生素的MIC值沒(méi)有發(fā)生明顯的變化,表明缺失acrAB及其調(diào)控因子沒(méi)有對(duì)SH10的藥物敏感性產(chǎn)生顯著的影響。另外,我們?cè)诎牍腆w培養(yǎng)基上測(cè)定了這些缺失株的遷移力。數(shù)據(jù)顯示,缺失marA、ramA和sox R后,細(xì)菌在培養(yǎng)基上移動(dòng)的半徑由27 mm下降至18.3-21.7 mm(P0.05或P0.01);而缺失marR、ramR和soxS時(shí),細(xì)菌的移動(dòng)半徑由27 mm升高至31-33.7 mm(P0.05)。缺失acrA或acrB時(shí),細(xì)菌的移動(dòng)半徑也增大,但變化不顯著;而缺失tolC時(shí),細(xì)菌的移動(dòng)半徑減小。以上結(jié)果表明,轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子marA、ramA和soxR對(duì)鼠傷寒沙門氏菌SH10的遷移力起著正向調(diào)控的作用。為研究鼠傷寒沙門氏菌耐多藥外排泵AcrAB-TolC是否存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制,我們檢測(cè)了SH10在加入外排泵抑制劑PAβN后acrAB-tolC各基因的表達(dá)情況,以及缺失acrA或acrB后剩余外排泵基因和調(diào)控因子的表達(dá)水平。熒光定量數(shù)據(jù)顯示,加入PAβN后,acrA和acrB的表達(dá)水平升高到原來(lái)的2.32倍和1.57倍,marA和ramA的表達(dá)水平分別提高到原來(lái)的1.40倍和2.94倍。當(dāng)缺失acrA時(shí),acrB和tolC的表達(dá)水平升高到原來(lái)的2.92倍和2.48倍,而marA和ramA則分別升高到原來(lái)的2.29倍和2.89倍。當(dāng)缺失tolC時(shí),acrA和acrB的表達(dá)升高了2.48倍和2.45倍,mar A和ramA分別升高了3.03倍和3.07倍。因此,當(dāng)沙門氏菌外排泵AcrAB-TolC功能失活時(shí),細(xì)菌會(huì)通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因ramA和marA反過(guò)來(lái)促進(jìn)acrAB-tolC的表達(dá)。為研究鼠傷寒沙門氏菌SH10主要外排泵acrAB與其余外排泵間的關(guān)系,我們量測(cè)定了?acrAB::kan缺失株中另外八種外排泵基因acr F、acrD、mdsB、mdtB、macA、emrA、mdfA和mdtK的表達(dá)水平。除mdtK外,其余的外排泵的表達(dá)水平均不同程度上調(diào)(1.59-2.26倍,P0.05)。同樣地,我們還檢測(cè)了通過(guò)P22構(gòu)建的?acrABmarA::kan、?acrABramA::kan和?acrABsoxS::kan雙基因缺失株中另外八種外排泵的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,缺失?acrAB::kan中的調(diào)控基因marA、ram A和soxS,可使缺失株中其它外排泵的表達(dá)水平顯著地降低(0.26-0.85倍、0.18-0.88倍和0.27-1.26倍,P0.05)。另外,我們也檢測(cè)了?acrEF::kan、?acrD::kan、?mdtABC::kan、?mdsABC::kan、?macAB::kan、?emrAB::kan、?mdfA::kan和?mdtK::kan中acrAB-tolC及其調(diào)控因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,在這八株外排泵缺失株中,acrAB-tolC及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因marA和ramA的表達(dá)水平都顯著的增加(P0.05),而且其遷移力也有所增強(qiáng)。以上結(jié)果表明,沙門氏菌SH10可以通過(guò)marA和ramA來(lái)實(shí)現(xiàn)acrAB與其它外排泵間的相互調(diào)節(jié)。在環(huán)丙沙星的選擇壓力下,我們?cè)隗w外篩選出鼠傷寒沙門氏菌臨床株SH10和標(biāo)準(zhǔn)株SL1344的不同耐藥水平的誘導(dǎo)菌。其中SH-1和SL-1為敏感性降低株(MICcip為0.125μg/mL和0.25μg/mL),SH-2和SL-2為低水平耐藥株(MICcip均為2μg/mL),SH-3和SL-3為高水平耐藥菌(MICcip為8μg/mL)。QRDR突變檢測(cè)結(jié)果顯示,這些不同耐藥水平的誘導(dǎo)菌中,只在GyrA的83位檢測(cè)到突變S83F。于是,我們又檢測(cè)了誘導(dǎo)菌中主要耐多藥泵acrAB-tolC及其主要的轉(zhuǎn)錄激活因子ramA、marA和soxS的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,隨著耐藥水平的升高,外排泵的表達(dá)水平也不斷隨之升高(P0.05),并且是由ramA介導(dǎo)的。MIC結(jié)果顯示,高水平耐壓株SH-3和SL-3表現(xiàn)為多重耐藥。另外我們也檢測(cè)了這些誘導(dǎo)菌的適應(yīng)性,結(jié)果顯示隨著細(xì)菌耐藥性的增加,細(xì)菌的生長(zhǎng)能力、細(xì)菌毒力和遷移力都呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì)。結(jié)論:當(dāng)鼠傷寒沙門氏菌SH10耐多藥泵acrAB功能失活時(shí),細(xì)菌一方面可以通過(guò)全局性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子marA和ramA反饋性促進(jìn)acrAB的表達(dá);另一方面,細(xì)菌可以通過(guò)激活marA和ramA的表達(dá)來(lái)促進(jìn)其它的外排泵的表達(dá)尤其是RND家族的外排泵,以補(bǔ)償細(xì)菌喪失的外排功能。另外,當(dāng)其它外排泵缺失時(shí),也會(huì)通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子反過(guò)來(lái)影響acrAB的表達(dá)。體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明,AcrABTolC在SH10和SL1344獲得高水平耐藥的過(guò)程中發(fā)揮著最主要的作用。
【關(guān)鍵詞】：鼠傷寒沙門氏菌 多重耐藥泵 基因敲除 調(diào)控機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-9
• 1 前言9-16
• 2 材料與方法16-32
• 2.1 材料16-19
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和參考菌株的來(lái)源16
• 2.1.2 常用的培養(yǎng)基和試劑16-17
• 2.1.3 Real-Time PCR用試劑17
• 2.1.4 常用的試劑盒17
• 2.1.5 常用試劑的配制17-18
• 2.1.6 主要儀器設(shè)備18-19
• 2.2 方法19-32
• 2.2.1 沙門氏菌敲除株的構(gòu)建19-23
• 2.2.2 噬菌體P22介導(dǎo)的沙門氏菌基因敲除23-24
• 2.2.3 鼠傷寒沙門氏菌外排泵基因表達(dá)水平的檢測(cè)24-28
• 2.2.4 沙門氏菌基因缺失株遷移力檢測(cè)28
• 2.2.5 沙門氏菌的體外誘導(dǎo)28-29
• 2.2.6 QRDR（s）與ramR-ramA基因突變的檢測(cè)29-31
• 2.2.7 誘導(dǎo)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定31
• 2.2.8 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)31-32
• 2.2.9 二倍瓊脂稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MICs）32
• 3 結(jié)果與分析32-49
• 3.1 基因敲除株的構(gòu)建32-37
• 3.1.1 pKD46介導(dǎo)的基因敲除32-34
• 3.1.2 噬菌體P22介導(dǎo)的基因敲除34-35
• 3.1.3 acrAB-tolC及其調(diào)控因子缺失株耐藥性和遷移力的測(cè)定35-37
• 3.2 沙門氏菌中RND外排泵AcrAB-TolC對(duì)自身的反饋調(diào)節(jié)37-39
• 3.3 外排泵系統(tǒng)間的相互調(diào)節(jié)機(jī)制39-44
• 3.4 環(huán)丙沙星選擇壓力下沙門氏菌耐藥機(jī)制的研究44-47
• 3.5 環(huán)丙沙星選擇壓力下沙門氏菌適應(yīng)性的研究47-49
• 4.討論49-54
• 全文總結(jié)54-55
• 致謝55-56
• 參考文獻(xiàn)56-58

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 曾曉芳;畜產(chǎn)品中沙門氏菌污染的檢測(cè)與控制[J];四川畜牧獸醫(yī);2003年04期

2 張燕,朱超;我國(guó)沙門氏菌病和菌型分布概況[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2002年03期

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本文編號(hào)：619526