發(fā)布時(shí)間：2017-08-01 09:34

  本文關(guān)鍵詞：非編碼小RNA RyhB-1與IsrE在腸炎沙門氏菌致病性上的相互作用研究

  更多相關(guān)文章： 腸炎沙門氏菌 ryhB-1 isrE 毒力 致病性

【摘要】：RyhB是一種大小為90bp左右的細(xì)菌非編碼小RNA,可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。前人研究表明存在于鼠傷寒沙門氏菌和霍亂弧菌中的兩種RyhB同源物RyhB-1與IsrE可調(diào)控細(xì)菌生物膜形成、趨化性和耐酸性。本研究對(duì)腸炎沙門氏菌sRNA RyhB兩種同源物RyhB-1與IsrE在腸炎沙門氏菌致病性上的作用,以及兩種同源物能否對(duì)毒力調(diào)控發(fā)揮協(xié)同作用進(jìn)行了如下的研究。1腸炎沙門氏菌50336 RyhB-1與IsrE在不同環(huán)境下表達(dá)量檢測根據(jù)腸炎沙門氏菌RyhB-1與IsrE序列設(shè)計(jì)引物,利用熒光定量PCR反應(yīng)檢測二者在腸炎沙門氏菌不同生長時(shí)期時(shí)處于鐵匱乏、模擬腸道環(huán)境、感染巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)條件下的表達(dá)量,分析RyhB-1與IsrE在不同培養(yǎng)時(shí)期和不同培養(yǎng)條件時(shí)表達(dá)量的變化規(guī)律尤其是模擬宿主內(nèi)環(huán)境時(shí)表達(dá)情況,結(jié)果顯示,在鐵匱乏條件下,對(duì)數(shù)期時(shí),RyhB-1與IsrE的表達(dá)水平均比普通LB培養(yǎng)時(shí)高2倍,穩(wěn)定期時(shí),RyhB-1與IsrE的表達(dá)量分別是普通LB培養(yǎng)條件下的2.5倍和3倍,表明兩種sRNA表達(dá)量的升高與該菌在缺鐵環(huán)境中需要高效吸收鐵有關(guān),推測兩種sRNA可調(diào)控鐵代謝。模擬腸道環(huán)境下,對(duì)數(shù)期時(shí)RyhB-1與IsrE的表達(dá)水平與普通LB培養(yǎng)時(shí)相比,分別上升3.5倍和3倍,穩(wěn)定期時(shí)上升1.3倍和1.5倍。與感染巨噬細(xì)胞前相比,感染1h和4h時(shí),RyhB-1的表達(dá)水平分別上升2倍與5.5倍,IsrE的表達(dá)水平分別上升4.5倍與8.5倍。表明了RyhB-1與IsrE在受到環(huán)境變化壓力下被誘導(dǎo)表達(dá)使表達(dá)量顯著升高,IsrE的表達(dá)水平變化高于RyhB-1,推測二者均與腸炎沙門氏菌的毒力相關(guān),但對(duì)毒力的調(diào)控方式可能不同。2腸炎沙門氏菌50336 RyhB-1與IsrE雙缺失突變株及相應(yīng)回補(bǔ)株構(gòu)建本課題前期利用λ-Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建了ryhB-1和isrE單基因缺失株,本研究將繼續(xù)利用同源重組系統(tǒng)構(gòu)建出ryhB-1和isr E雙基因缺失株,在此基礎(chǔ)上,分別設(shè)計(jì)含有ryhB-1和isrE序列和上下游非編碼序列以及酶切位點(diǎn)的引物,利用pBR322表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建isrE單缺失株的回補(bǔ)株50336△isrE/pisrE,利用pACYC184表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建ryhB-1單缺失株的回補(bǔ)株50336△ryhB-1/pryhB-1,利用pBR322表達(dá)質(zhì)粒和pACYC184表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建ryhB-1和isrE雙缺失株的回補(bǔ)株50336△ryhB-1/△isrE/pryhB-1/pisrE,為進(jìn)一步探索sRNA RyhB的兩種同源物ryhB-1和isrE在腸炎沙門氏菌致病過程中的作用提供材料。3體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)分析腸炎沙門氏菌50336 RyhB-1與IsrE在致病性方面的作用通過腸炎沙門氏菌野生株50336、ryhB-1和isrE單雙基因缺失株以及相應(yīng)的回補(bǔ)株檢測細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力、生物膜形成能力、對(duì)各運(yùn)動(dòng)性關(guān)鍵基因表達(dá)量、對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲力和黏附力、對(duì)巨噬細(xì)胞的抗吞噬力與在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活率、對(duì)易感動(dòng)物1日齡雛雞的半數(shù)致死量,死亡率,體內(nèi)細(xì)菌分布,分析RyhB-1與IsrE在調(diào)控毒力與致病性上的差異性,結(jié)果顯示ryhB-1或isrE單一基因的缺失會(huì)下調(diào)這些能力,毒力減弱；ryhB-1和isrE雙基因的缺失對(duì)這些能力的下調(diào)更為明顯,毒力下降更為顯著,表明兩種sRNA均對(duì)腸炎沙門氏菌致病性具有增強(qiáng)作用。
【關(guān)鍵詞】：腸炎沙門氏菌 ryhB-1 isrE 毒力 致病性
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378;S852.61
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 符號(hào)說明10-11
• 綜述：沙門氏菌非編碼小RNA研究進(jìn)展11-25
• 1 細(xì)菌非編碼小RNA研究進(jìn)展11-13
• 1.1 細(xì)菌非編碼小RNA的發(fā)現(xiàn)11-12
• 1.2 細(xì)菌非編碼小RNA的特征與類型12
• 1.3 細(xì)菌非編碼小RNA的生物學(xué)功能12-13
• 2 沙門氏菌非編碼sRNA RyhB研究進(jìn)展13-15
• 2.1 沙門氏菌非編碼sRNA RyhB-1與IsrE的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)13
• 2.2 RyhB-1與IsrE的作用機(jī)制13-14
• 2.3 RyhB-1與1srE的生物學(xué)功能14-15
• 2.3.1 RyhB-1與IsrE調(diào)控鐵代謝14
• 2.3.2 RyhB-1與IsrE調(diào)控細(xì)菌致病力14-15
• 4 總結(jié)15-17
• 參考文獻(xiàn)17-25
• 研究一 腸炎沙門氏菌50336 RyhB-1和IsrE在不同環(huán)境下表達(dá)量檢測25-36
• 1 材料26-27
• 1.1 菌株與細(xì)胞系26
• 1.2 培養(yǎng)基和主要試劑26
• 1.3 主要儀器26-27
• 2 方法27-30
• 2.2 RyhB-1與IsrE在不同培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)期表達(dá)量檢測27-30
• 2.2.1 qRT-PCR各基因引物設(shè)計(jì)27
• 2.2.2 HD-11細(xì)胞培養(yǎng)與傳代27
• 2.2.3 Trizol法提取RNA27-28
• 2.2.4 cDNA制備28
• 2.2.5 qRT-PCR反應(yīng)28-29
• 2.2.6 RyhB-1與IsrE在鐵匱乏時(shí)對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的表達(dá)量檢測29
• 2.2.7 RyhB-1與IsrE在模擬腸道環(huán)境下對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的表達(dá)量檢測29
• 2.2.8 RyhB-1與IsrE在感染雞源巨噬細(xì)胞后表達(dá)量檢測29-30
• 3 結(jié)果30-33
• 3.1 RyhB-1與IsrE在鐵匱乏時(shí)對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的表達(dá)量檢測30-31
• 3.2 RyhB-1與IsrE在模擬腸道環(huán)境下對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的表達(dá)量檢測31-32
• 3.3 RyhB-1與IsrE感染巨噬細(xì)胞HD-11后表達(dá)量檢測32-33
• 4 討論33-34
• 參考文獻(xiàn)34-36
• 研究二 腸炎沙門氏菌50336 RyhB-1與IsrE雙缺失突變株及相應(yīng)回補(bǔ)株的構(gòu)建36-49
• 1 材料37-38
• 1.1 菌株與質(zhì)粒37
• 1.2 培養(yǎng)基和主要試劑37
• 1.3 主要儀器37-38
• 2 方法38-44
• 2.1 腸炎沙門氏菌RyhB-1與IsrE雙缺失突變株50336△ryhB-1/△isrE的構(gòu)建38-42
• 2.1.1 PCR引物設(shè)計(jì)38
• 2.1.2 帶氯霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物制備與純化38-39
• 2.1.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備以及pKD46的轉(zhuǎn)化39
• 2.1.4 Red重組酶誘導(dǎo)和帶氯霉素抗性PCR產(chǎn)物片段的電轉(zhuǎn)化39-40
• 2.1.5 質(zhì)粒pKD46消除40
• 2.1.6 一次同源重組菌50336△ryhB-1/△isrE：：cat的PCR鑒定40-41
• 2.1.7 FLP位點(diǎn)專一性重組41
• 2.1.8 二次同源重組菌50336△ryhB-1/△isrE的PCR鑒定41-42
• 2.2 回補(bǔ)株50336△ryhB-1/pryhB-1和50336△ryhB-1/△isrE/pryhB-1/pisrE的構(gòu)建42-44
• 2.2.1 回補(bǔ)片段PCR產(chǎn)物制備42
• 2.2.2 載體質(zhì)粒pACYC184、質(zhì)粒pBR322與PCR產(chǎn)物雙酶切42-43
• 2.2.3 酶切產(chǎn)物連接與鑒定43
• 2.2.4 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化與回補(bǔ)株的構(gòu)建43-44
• 3 結(jié)果44-46
• 3.1 帶氯霉素抗性基因PCR產(chǎn)物鑒定44
• 3.2 一次同源重組菌50336△ryhB-1/△isrE：：cat與二次同源重組菌50336△ryhB-1/△isrE鑒定44-45
• 3.3 雙缺失株50336△ryhB-1/△isrE序列分析鑒定45-46
• 3.4 回補(bǔ)株50336△ryhB-1/pryhB-1和50336△ryhB-1/△isrE/pryhB-1/pisrE鑒定46
• 4 討論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-49
• 研究三 體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)分析腸炎沙門氏菌50336 RyhB-1和IsrE在致病性方面的作用49-74
• 1 材料50-51
• 1.1 菌株、細(xì)胞系與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50
• 1.2 培養(yǎng)基和主要試劑50-51
• 1.3 主要儀器51
• 2 方法51-56
• 2.1 RyhB-1與IsrE相關(guān)各菌株生長曲線測定51
• 2.2 RyhB-1與IsrE對(duì)腸炎沙門氏菌運(yùn)動(dòng)能力的影響51-52
• 2.2.1 半固體運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)51
• 2.2.2 RyhB-1與IsrE對(duì)運(yùn)動(dòng)性相關(guān)基因的qRT-PCR反應(yīng)51-52
• 2.3 RyhB-1與IsrE對(duì)腸炎沙門氏菌生物膜形成能力的影響52-53
• 2.3.1 結(jié)晶紫染色法定性測定野生株、缺失株與回補(bǔ)株的生物膜形成能力52
• 2.3.2 結(jié)晶紫染色法定量測定野生株、缺失株與回補(bǔ)株的生物膜形成能力52-53
• 2.4 RyhB-1與IsrE對(duì)腸上皮細(xì)胞Caco-2侵襲力的影響53
• 2.5 RyhB-1與IsrE對(duì)腸上皮細(xì)胞Caco-2黏附力的影響53-54
• 2.6 RyhB-1與IsrE對(duì)雞源巨噬細(xì)胞HD-11抗吞噬力測定54-55
• 2.7 RyhB-1與IsrE在雞源巨噬細(xì)胞HD-11內(nèi)存活率測定55
• 2.8 RyhB-1 and IsrE對(duì)易感動(dòng)物毒力的影響55-56
• 2.8.1 對(duì)一日齡雛雞攻毒后LD50和死亡率測定55-56
• 2.8.2 臨床變化以及病理解剖變化56
• 2.8.3 攻毒組雛雞體內(nèi)細(xì)菌的分離與鑒定56
• 2.8.4 攻毒組雛雞體內(nèi)細(xì)菌分布檢測56
• 3 結(jié)果56-71
• 3.1 生長曲線測定結(jié)果56-58
• 3.2 RyhB-1與IsrE對(duì)腸炎沙門氏菌運(yùn)動(dòng)能力的影響58-61
• 3.2.1 半固體運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)結(jié)果58-59
• 3.2.2 與運(yùn)動(dòng)性相關(guān)的基因qRT-PCR結(jié)果59-61
• 3.3 RyhB-1與IsrE對(duì)腸炎沙門氏菌生物膜形成能力的影響61-62
• 3.3.1 RyhB-1與IsrE對(duì)腸炎沙門氏菌生物膜形成定性分析結(jié)果61
• 3.3.2 RyhB-1與IsrE對(duì)腸炎沙門氏菌生物膜形成定量分析結(jié)果61-62
• 3.4 腸上皮細(xì)胞Caco-2侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果62-63
• 3.5 腸上皮細(xì)胞Caco-2黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果63-66
• 3.6 RyhB-1與IsrE突變株對(duì)雞源巨噬細(xì)胞的抗吞噬力及其在巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌存活率的測定66-68
• 3.7 RyhB-1與IsrE對(duì)易感動(dòng)物毒力的影響68-71
• 3.7.1 一日齡雛雞攻毒LD50與死亡率測定結(jié)果68-69
• 3.7.2 臨床變化以及病理解剖變化69
• 3.7.3 攻毒組雛雞體內(nèi)細(xì)菌分離與鑒定結(jié)果69-70
• 3.7.4 攻毒組雛雞體內(nèi)細(xì)菌分布情況70-71
• 4 討論71-72
• 參考文獻(xiàn)72-74
• 全文小結(jié)74-75
• 致謝75-76

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