本文關(guān)鍵詞：豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、沙門氏菌DNAH和LAMP檢測方法的建立

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【摘要】：豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)、沙門氏菌(Salmonella,Sal)三種病原菌均能引起豬的重大傳染性疾病,分別是豬呼吸道疾病綜合征常見的原發(fā)性病原和繼發(fā)性病原,引發(fā)的相關(guān)疾病具有高發(fā)病率和死亡率,給世界各地的養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。早期診斷對疾病的防治非常關(guān)鍵,目前,針對上述三種細(xì)菌的檢測方法主要以傳統(tǒng)檢測方法為主,兼有PCR方法、基因芯片方法等,但都存在一定的不足,如檢測周期長、敏感性較低等,無法滿足大批量樣品快速準(zhǔn)確檢測。因此,迫切需要建立高通量、簡便快速、特異強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好的檢測方法。本研究分別運(yùn)用夾心DNA雜交技術(shù)(Sandwich DNA hybridization assay,DNAH)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification assays,LAMP),針對上述三種病原菌,各自建立了DNAH和LAMP兩種快速檢測方法,為APP、HPS、Sal病原菌的疫病早期診斷與治療、疫情監(jiān)控、流行病學(xué)調(diào)查等提供有效的技術(shù)保障,以減少傳染病對養(yǎng)豬業(yè)的危害,促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)健康穩(wěn)定的發(fā)展。同時(shí),作為一種新型的檢測技術(shù)儲(chǔ)備研究更具有重要的前瞻意義。本研究的試驗(yàn)方法和結(jié)果如下:1、參照Gen Bank中登錄的不同血清型豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的Apx IVA基因序列,副豬嗜血桿菌的16S r RNA基因序列以及沙門氏菌的inv A基因序列,通過MEGA5.0軟件對序列進(jìn)行比對與分析,利用primer 5軟件進(jìn)行夾心DNA雜交技術(shù)一條捕獲探針和一條檢測探針的設(shè)計(jì),利用在線生物軟件Primer Explorer V4進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)6條引物的設(shè)計(jì)。將設(shè)計(jì)的三種病原菌各自的探針和引物在NCBI上進(jìn)行Blast比對,特異性均較高。2、通過對三種病原菌進(jìn)行探針濃度、核酸雜交液探針液配比以及雜交時(shí)間和雜交溫度的優(yōu)化,分別建立了豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、沙門氏菌的夾心DNA雜交檢測方法,并進(jìn)行了特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果顯示:豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的夾心DNA雜交檢測方法僅與目標(biāo)病原菌有特異性的雜交反應(yīng),與其它相關(guān)病原菌均無特異性雜交;該方法的最低檢測限為0.46 CFU/m L;不同樣品重復(fù)測定的OD450值變異系數(shù)CVi在8.30%~10.29%之間,不同樣品用不同批次的96孔板所測的OD450值變異系數(shù)CVo在16.78%~20.07%之間,具有良好的精確度。副豬嗜血桿菌的夾心DNA雜交檢測方法具有良好的特異性,僅與目標(biāo)病原菌發(fā)生特異性雜交,而與其它相關(guān)病原菌均無雜交反應(yīng),該方法的最低檢測限為0.31 CFU/m L,批內(nèi)變異系數(shù)CVi在10.97%~16.22%之間,批間變異系數(shù)CVo在18.32%~22.50%之間。沙門氏菌的夾心DNA雜交檢測方法僅與三種不同血清型的沙門氏菌發(fā)生特異性的雜交反應(yīng),而與其它相關(guān)病原菌均無特異性雜交反應(yīng),該方法的最低檢出限為1.2 CFU/m L,批內(nèi)變異系數(shù)CVi在16.53%~17.97%之間,批間變異系數(shù)CVo在16.33%~22.10%之間。3、通過對三種病原菌進(jìn)行反應(yīng)溫度、內(nèi)引物濃度以及環(huán)引物濃度的優(yōu)化,分別建立了豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法,并進(jìn)行了相應(yīng)的特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果顯示:豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法只對該細(xì)菌的DNA有特異性擴(kuò)增,對其它相關(guān)病原均無特異性的擴(kuò)增,最低檢測限為0.307 fg/μL,具有良好的批內(nèi)重復(fù)性和批間穩(wěn)定性,變異系數(shù)CV分別為0.67%和2.21%;副豬嗜血桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法只對其目標(biāo)菌DNA有特異性擴(kuò)增,對其余病原菌無特異性擴(kuò)增,最低檢測限為0.175 fg/μL,批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間穩(wěn)定性試驗(yàn)的變異系數(shù)CV分別為0.76%和3.84%;沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法只對三種不同血清型的沙門氏菌DNA有特異性擴(kuò)增,對其余病原體均無特異性擴(kuò)增反應(yīng),檢測敏感性為0.810 fg/μL,批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間穩(wěn)定性試驗(yàn)的變異系數(shù)CV分別為1.47%和2.45%。4、用本研究建立的兩種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌快速檢測方法與SN/T 1447-2011標(biāo)準(zhǔn)中豬傳染性胸膜肺炎套式PCR檢測方法,同時(shí)對204份臨床疑似豬傳染性胸膜肺炎發(fā)病豬的肺臟樣品進(jìn)行對比分析,結(jié)果顯示:三種方法對豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌檢出率均為4.9%,符合率為100%,本研究建立的兩種方法與標(biāo)準(zhǔn)公布的套式PCR方法相比,其檢測時(shí)間大幅縮短。用本研究建立的兩種副豬嗜血桿菌快速檢測方法與NY/T 2417-2013標(biāo)準(zhǔn)公布的方法,同時(shí)對195份臨床疑似感染副豬嗜血桿菌的病豬鼻拭子進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示:本研究建立的兩種方法檢測出的副豬嗜血桿菌陽性率均為4.62%,標(biāo)準(zhǔn)公布的PCR方法檢出陽性率為3.08%,其陽性樣品的檢出低于本研究建立的兩種方法,且檢測時(shí)間也明顯較長。用本研究建立的兩種沙門氏菌快速檢測方法與SN/T 1869-2007標(biāo)準(zhǔn)公布的沙門氏菌檢測方法,同時(shí)對371份臨床疑似感染沙門氏菌病豬肉樣品進(jìn)行檢測分析,結(jié)果顯示:本研究建立的兩種方法檢出沙門氏菌的陽性率均為6.2%,標(biāo)準(zhǔn)公布的沙門氏菌PCR方法檢出陽性率為5.7%,表明DNAH和LAMP檢測方法對沙門氏菌的陽性檢出率比PCR方法高,且耗時(shí)比PCR方法短。綜上所述,本研究分別針對三種常見豬傳染性疾病相關(guān)病原菌建立的兩種快速檢測方法,均有較高的特異性、敏感性和穩(wěn)定性,并在較短時(shí)間內(nèi)(DNAH和LAMP方法分別在1.5 h和1 h內(nèi)完成檢測)實(shí)現(xiàn)對單個(gè)病原菌感染的樣品進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒別。
【關(guān)鍵詞】：豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌 副豬嗜血桿菌 沙門氏菌 DNAH LAMP
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.28
【目錄】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 第1章 綜述12-22
• 1.1 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的研究現(xiàn)狀12-14
• 1.1.1 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的生物學(xué)特征12
• 1.1.2 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的血清型分類12
• 1.1.3 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的毒力因子12-13
• 1.1.4 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的流行病學(xué)研究13
• 1.1.5 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的檢測方法研究進(jìn)展13-14
• 1.2 副豬嗜血桿菌的研究現(xiàn)狀14-15
• 1.2.1 副豬嗜血桿菌的生物學(xué)特征14
• 1.2.2 副豬嗜血桿菌的血清學(xué)分類14
• 1.2.3 副豬嗜血桿菌的毒力因子14
• 1.2.4 副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)研究14-15
• 1.2.5 副豬嗜血桿菌的檢測方法研究進(jìn)展15
• 1.3 沙門氏菌的研究現(xiàn)狀15-17
• 1.3.1 沙門氏菌的生物學(xué)特征15-16
• 1.3.2 沙門氏菌的血清學(xué)分類16
• 1.3.3 沙門氏菌的毒力因子16
• 1.3.4 沙門氏菌的流行病學(xué)研究16
• 1.3.5 沙門氏菌的檢測方法研究進(jìn)展16-17
• 1.4 夾心DNA雜交技術(shù)(DNAH)17-18
• 1.4.1 DNAH技術(shù)概述17
• 1.4.2 DNAH技術(shù)反應(yīng)原理17-18
• 1.4.3 DNAH技術(shù)特點(diǎn)18
• 1.4.4 DNAH技術(shù)發(fā)展前景18
• 1.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)18-22
• 1.5.1 LAMP技術(shù)概述18-19
• 1.5.2 LAMP技術(shù)反應(yīng)原理19
• 1.5.3 LAMP技術(shù)特點(diǎn)19-20
• 1.5.4 LAMP技術(shù)發(fā)展前景20-22
• 第2章 引言22-26
• 2.1 研究目的及意義22
• 2.2 研究內(nèi)容22-23
• 2.2.1 基因序列分析及探針和引物的分析22
• 2.2.2 分別建立三種病原菌的DNAH檢測方法22-23
• 2.2.3 分別建立三種病原菌的LAMP檢測方法23
• 2.2.4 方法間的比較23
• 2.3 技術(shù)路線23-26
• 2.3.1 分別建立三種病原菌DNAH檢測方法的技術(shù)路線，見圖 2-1。23-24
• 2.3.2 分別建立三種病原菌LAMP檢測方法的技術(shù)路線，見圖 2-2。24-26
• 第3章 三種病原菌DNAH檢測方法的優(yōu)化及建立26-48
• 3.1 材料、主要試劑及儀器26-28
• 3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株26
• 3.1.2 主要試劑26-27
• 3.1.3 主要儀器27
• 3.1.4 主要試劑配制27-28
• 3.2 方法28-32
• 3.2.1 細(xì)菌的增殖28
• 3.2.2 序列分析及探針設(shè)計(jì)28-29
• 3.2.3 DNAH技術(shù)操作步驟29-30
• 3.2.4 DNAH檢測條件的優(yōu)化30
• 3.2.5 DNAH特異性試驗(yàn)30-31
• 3.2.6 DNAH敏感性試驗(yàn)與對比試驗(yàn)31-32
• 3.2.7 DNAH重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)32
• 3.3 結(jié)果32-46
• 3.3.1 探針設(shè)計(jì)32-34
• 3.3.2 DNAH檢測條件的優(yōu)化及建立34-37
• 3.3.3 DNAH特異性試驗(yàn)37-39
• 3.3.4 DNAH敏感性試驗(yàn)與對比試驗(yàn)39-43
• 3.3.5 DNAH重復(fù)性試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)43-46
• 3.4 討論46-48
• 3.4.1 目的基因的選擇46
• 3.4.2 探針的設(shè)計(jì)及篩選46
• 3.4.3 三種病原菌DNAH檢測方法的評(píng)價(jià)46-47
• 3.4.4 DNAH檢測方法的應(yīng)用評(píng)價(jià)47-48
• 第4章 三種病原菌LAMP檢測方法的優(yōu)化及建立48-78
• 4.1 材料、主要試劑及儀器48-51
• 4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株、毒株48-49
• 4.1.2 主要試劑49-50
• 4.1.3 主要儀器50
• 4.1.4 主要試劑配制50-51
• 4.2 方法51-54
• 4.2.1 細(xì)菌的增殖51
• 4.2.2 核酸的提取51-52
• 4.2.3 序列分析及引物設(shè)計(jì)52
• 4.2.4 LAMP檢測條件的優(yōu)化52-53
• 4.2.5 LAMP特異性試驗(yàn)53
• 4.2.6 LAMP敏感性試驗(yàn)與對比試驗(yàn)53-54
• 4.2.7 LAMP重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)54
• 4.3 結(jié)果54-73
• 4.3.1 引物設(shè)計(jì)54-56
• 4.3.2 引物的驗(yàn)證56-58
• 4.3.3 LAMP檢測條件的優(yōu)化及建立58-64
• 4.3.4 LAMP特異性試驗(yàn)64-66
• 4.3.5 LAMP敏感性試驗(yàn)與對比試驗(yàn)66-71
• 4.3.6 LAMP重復(fù)性試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)71-73
• 4.4 臨床應(yīng)用73-75
• 4.4.1 APP檢測方法的臨床應(yīng)用73
• 4.4.2 APP臨床檢測結(jié)果與分析73-74
• 4.4.3 HPS檢測方法的臨床應(yīng)用74
• 4.4.4 HPS臨床檢測結(jié)果與分析74
• 4.4.5 Sal檢測方法的臨床應(yīng)用74
• 4.4.6 Sal檢測結(jié)果與分析74-75
• 4.5 討論75-78
• 4.5.1 LAMP引物的設(shè)計(jì)及篩選75
• 4.5.2 三種病原菌LAMP檢測方法的評(píng)價(jià)75-76
• 4.5.3 LAMP技術(shù)的改進(jìn)與發(fā)展76
• 4.5.4 兩種快速檢測方法的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)76-78
• 第5章 結(jié)論78-80
• 參考文獻(xiàn)80-88
• 附錄 188-90
• 聲明90-92
• 致謝92-94
• 攻讀碩士期間論文發(fā)表及專利、項(xiàng)目參與情況94

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3 靳國旺;安陽地區(qū)副豬嗜血桿菌的分離鑒定及蜂膠滅活苗的制備[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 付書林;副豬嗜血桿菌重要免疫原性相關(guān)蛋白發(fā)掘及GAPDH免疫調(diào)節(jié)機(jī)理研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

5 汪洋;副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究與環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法的建立[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

6 周明光;副豬嗜血桿菌新型免疫原性蛋白的發(fā)掘與鑒定及細(xì)胞毒素的鑒定與功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

7 都啟晶;副豬嗜血桿菌基因組表達(dá)文庫的構(gòu)建與其莢膜多糖輸出蛋白基因的篩選和免疫原性研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

8 蔡旭旺;副豬嗜血桿菌的分離鑒定及診斷方法與滅活疫苗的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

9 樂敏;副豬嗜血桿菌基因組學(xué)及毒力相關(guān)因子研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

10 李軍星;副豬嗜血桿菌分子流行病學(xué)調(diào)查及其HSP70對PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白GP3/GP5的免疫協(xié)同作用研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 苗立中;副豬嗜血桿菌熒光定量PCR方法建立及其分離株高密度發(fā)酵研究[D];吉林大學(xué);2012年

2 張悅;副豬嗜血桿菌耐藥性調(diào)查及其對氟苯尼考耐藥分子機(jī)制的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

3 牛惠;副豬嗜血桿菌細(xì)胞致死膨脹毒素細(xì)胞毒性機(jī)制研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

4 米丁丹;副豬嗜血桿菌HbpA蛋白功能及其致病中作用的初步研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

5 陳凡杰;副豬嗜血桿菌HAPS_ 2096基因介導(dǎo)的天蠶素B抗性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 周杉杉;NOD1/2-RIP2信號(hào)通路參與副豬嗜血桿菌感染PK-15細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 李雪梅;副豬嗜血桿菌nanH基因和at1基因的功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

8 劉佳;副豬嗜血桿菌細(xì)胞致死膨脹毒素對細(xì)胞和仔豬致病作用研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 姚文龍;人乳寡糖LSTa和血清型5副豬嗜血桿菌莢膜多糖重復(fù)單元的化學(xué)酶法合成研究[D];山東大學(xué);2015年

10 馮芬芬;CpxA/R雙組份系統(tǒng)在副豬嗜血桿菌應(yīng)對刺激中的作用研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：591619