本文關鍵詞：布魯菌OMP16對RAW264.7細胞凋亡與免疫活性的影響及其免疫原性研究

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【摘要】：布魯菌(Brucella)可侵染動物和人,引起重要的人獸共患病布魯菌病(Brucellosis)。布魯菌病屬于二類傳染病,是世界五大人獸共患病——狂犬病、炭疽、布魯菌病、結核和豬流行性乙型腦炎之一。疫苗免疫是布魯菌病綜合防控的重要措施之一,而現有疫苗存在各方面的缺陷,不宜普遍使用。因此對新型疫苗的研發(fā)是布魯菌研究的主要目標之一。目前已知的布魯菌外膜蛋白(outer membrane proteins,OMPs)有7種,研究表明布魯菌OMP16和OMP19也是重要的保護性抗原。本研究制備布魯菌OMP16,優(yōu)化其表達與純化的條件;在RAW264.7細胞培養(yǎng)液中添加布魯菌OMP16,通過檢測細胞凋亡標志因子Caspase-3、內質網應激主要因子GRP78和CHOP及免疫因子IL-1β、IL-6、TNF-α的變化情況,探討布魯菌OMP16對RAW264.7細胞凋亡與免疫活性的影響;同時用布魯菌OMP16免疫Balb/c小鼠,檢測血清抗體水平,并進行小鼠感染試驗,觀察試驗動物的臨床表現、脾臟變化,檢測免疫因子,研究布魯菌OMP16的免疫原性。試驗結果如下:1.原核表達并通過NTA樹脂親和層析柱純化布魯菌OMP16,SDS-PAGE檢測目的蛋白的濃度。分別在22℃、26℃、30℃溫度條件下誘導7 h、8 h、9 h、10 h表達蛋白,用不同濃度咪唑20 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、250 mmol/L、500 mmol/L純化蛋白。確定的最佳條件:22℃誘導8 h,100 mmol/L與250 mmol/L咪唑洗脫2次。2.布魯菌OMP16在不同濃度及時間下刺激RAW264.7細胞,采用MTT法及Hoechst染色法篩選出OMP16的最佳作用濃度及時間:10μg/mL,36 h。設置OMP16刺激RAW264.7細胞組及對照組,用免疫熒光法及Western blot檢測到細胞凋亡的主要標志因子Caspase-3的表達量顯著升高(P0.001),實時定量PCR及Western blot檢測到內質網應激主要因子GRP78與CHOP的表達顯著升高,流式細胞術檢測到布魯菌OMP16刺激RAW264.7細胞發(fā)生了顯著凋亡,結果表明OMP16能夠促進細胞凋亡且內質網應激參與了OMP16促進RAW264.7細胞凋亡的調節(jié)。同時通過實時定量PCR檢測到免疫因子IL-1β、IL-6、TNF-α均表達上調,證明布魯菌OMP16能夠激發(fā)RAW264.7細胞的免疫活性。3.OMP16免疫組小鼠ELISA檢測血清抗體效價平均達到1∶106,進行感染試驗,感染第3天感染組小鼠開始表現精神沉郁、體重顯著下降、進食量減少、怕冷發(fā)抖、圍成一團,對照組、免疫感染組小鼠均不表現上述癥狀;實時定量PCR檢測小鼠第7天脾臟中免疫因子IL-1β、IL-6、TNF-α,與ELISA檢測血清免疫因子顯示感染組小鼠免疫因子的分泌顯著上升,免疫感染組與對照組的基本一致;結果表明布魯菌OMP16具有良好的免疫原性,并且對布魯菌感染具有一定的免疫保護作用。
【關鍵詞】：布魯菌OMP16 免疫原性 RAW264.7細胞 內質網應激 免疫因子 小鼠
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要5-7
• abstract7-11
• 文獻綜述11-22
• 第一章 布魯菌致病機制及防控研究進展11-22
• 1.1 布魯菌感染機制11-13
• 1.2 布魯菌致病因子13-17
• 1.2.1 脂多糖13-14
• 1.2.2 外膜蛋白14-17
• 1.2.3 Ⅳ型分泌系統(tǒng)17
• 1.3 內質網應激與布魯菌感染17-19
• 1.3.1 內質網應激介導的細胞凋亡18
• 1.3.2 內質網應激與布魯菌感染18-19
• 1.4 布魯菌病防控19-20
• 1.5 本研究目的意義及內容20-22
• 試驗研究22-51
• 第二章 布魯菌OMP16原核表達及純化22-29
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 載體和感受態(tài)細菌22
• 2.1.2 主要試劑22
• 2.1.3 實驗儀器22-23
• 2.2 方法23-25
• 2.2.1 pET-32a-OMP16原核表達載體鑒定23-24
• 2.2.2 布魯菌OMP16的表達純化及鑒定24-25
• 2.3 結果25-27
• 2.3.1 pET-32a-OMP16原核表達載體鑒定25-26
• 2.3.2 布魯菌OMP16純化及鑒定26-27
• 2.4 討論27-28
• 2.5 小結28-29
• 第三章 布魯菌OMP16對RAW264.7 細胞凋亡與免疫活性影響29-43
• 3.1 材料29-30
• 3.1.1 細胞株29
• 3.1.2 主要試劑29-30
• 3.1.3 實驗儀器30
• 3.2 方法30-35
• 3.2.1 OMP16作用于RAW264.7 細胞的最佳濃度及時間30-31
• 3.2.2 OMP16誘導RAW264.7 細胞凋亡的檢測31-33
• 3.2.3 OMP16誘導RAW264.7 細胞內質網應激主要因子檢測33-34
• 3.2.4 OMP16刺激RAW264.7 細胞相關免疫因子檢測34-35
• 3.3 結果35-41
• 3.3.1 OMP16最佳作用濃度及時間篩選35-37
• 3.3.2 RAW264.7 細胞凋亡檢測37-39
• 3.3.4 RAW264.7 細胞內質網應激主要因子檢測結果39-40
• 3.3.3 RAW264.7 細胞免疫因子檢測結果40-41
• 3.4 討論41-42
• 3.5 小結42-43
• 第四章 布魯菌OMP16免疫原性研究43-51
• 4.1 材料43
• 4.1.1 實驗動物及菌株43
• 4.1.2 主要試劑43
• 4.1.3 實驗儀器43
• 4.2 方法43-45
• 4.2.1 小鼠免疫試驗44
• 4.2.2 小鼠感染試驗44-45
• 4.3 結果45-49
• 4.3.1 免疫小鼠血清抗體效價檢測45
• 4.3.2 感染試驗45-49
• 4.4 討論49-50
• 4.5 小結50-51
• 結論51-52
• 參考文獻52-59
• 致謝59-60
• 作者簡介60

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本文編號：581688