本文關(guān)鍵詞：鴨源cathelicidin的分子克隆及體外生物學(xué)功能研究

  更多相關(guān)文章： 鴨 Cathelicidin 基因克隆 抑菌活性 抑菌機(jī)制

【摘要】：Cathelicidin是廣泛存在于脊椎動(dòng)物體內(nèi)的一類抗微生物多肽,整個(gè)肽包括信號(hào)肽、高度保守的cathelin域和功能肽,因其具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在整個(gè)抗菌肽家族中單獨(dú)形成一支。目前,哺乳動(dòng)物、魚類、兩棲動(dòng)物、鳥類等均有cathelicidin的發(fā)現(xiàn),且越來越多的cathelicidin正在被發(fā)現(xiàn)與研究。研究證明,cathelicidin除了具有高效廣譜抑菌活性外、還具有免疫調(diào)節(jié)活性,是機(jī)體免疫體系不可或缺的一部分,同時(shí)cathelicidin還具有抑制組織損傷并促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)血管生成、結(jié)合內(nèi)毒素等功能,具有廣闊的研究價(jià)值與應(yīng)用前景。在本試驗(yàn)中,以紹鴨為試驗(yàn)對(duì)象,通過基因克隆的方法首次獲得了鴨源cathelicidin抗菌肽基因編碼全序列,并對(duì)該肽dCATH的序列特點(diǎn)與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、體外生物學(xué)活性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制等進(jìn)行了研究與探討。根據(jù)原雞、鵪鶉、環(huán)頸雉、鴿子等禽類cathelicidin基因的序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn),設(shè)計(jì)一系列特異性引物,采用3'RACE-PCR的方法獲得了鴨cathelicidin的全基因編碼序列,整個(gè)開發(fā)閱讀框?yàn)?41 bp,編碼146個(gè)氨基酸,由17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、98個(gè)氨基酸的cathelin域和20個(gè)氨基酸的功能多肽組成,其中預(yù)測(cè)的功能肽d CATH序列為KRFWQLVPLAIKIYRAWKRR。通過序列對(duì)比與進(jìn)化樹分析獲知,dCATH與其他禽源物種的cathelicidin前體肽具有較高的同源性,但功能肽差異較大,表明dCATH基因在進(jìn)化過程中與其他禽源cathelicidin基因具有一定親緣關(guān)系,可能來自于一個(gè)共同的祖先,而功能肽的差異可能因?yàn)椴煌奈锓N面臨的病原微生物不同,而向著不同的方向進(jìn)化。CD圓二色譜測(cè)定d CATH以α螺旋結(jié)構(gòu)為主。抑菌試驗(yàn)表明d CATH對(duì)8種代表性測(cè)試菌具有高效的殺菌活性,平均MICs為4μM,對(duì)大腸桿菌MIC值甚至達(dá)到2μM。d CATH對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的損傷作用通過人紅細(xì)胞和Ha Cat細(xì)胞檢測(cè),發(fā)現(xiàn)d CATH在低濃度下,毒性較小,隨著濃度增加,肽對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的損傷程度也大幅度增強(qiáng),但是,培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清會(huì)明顯降低肽的溶血活性。d CATH具有良好的鹽離子和熱穩(wěn)定性,陽離子和高溫處理對(duì)肽的活性影響極小;但是酶穩(wěn)定性稍弱,試驗(yàn)中選定的四種酶均會(huì)影響肽的活性,其中在木瓜蛋白酶和蛋白酶K處理后,d CATH的MIC128μM。d CATH的抑菌機(jī)制的研究主要集中在細(xì)菌胞膜上,通過內(nèi)外膜通透性、內(nèi)膜去極化、掃描與透射電子顯微鏡等試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)d CATH同大多數(shù)肽一樣,能夠改變內(nèi)外膜的通透性,使胞內(nèi)物質(zhì)外流,從而達(dá)到殺死細(xì)菌的目的。
【關(guān)鍵詞】：鴨 Cathelicidin 基因克隆 抑菌活性 抑菌機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.2
【目錄】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 引言11-21
• 1.1 抗菌肽的研究進(jìn)展11-14
• 1.1.1 抗菌肽的概述11-12
• 1.1.2 抗菌肽的分類12
• 1.1.3 抗菌肽的生物學(xué)功能12-13
• 1.1.4 抑菌機(jī)制13
• 1.1.5 抗菌肽的應(yīng)用前景13-14
• 1.2 Cathelicdin類抗菌肽的研究進(jìn)展14-19
• 1.2.1Cathelicidins的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)14-15
• 1.2.2 Cathelicidins的表達(dá)與合成調(diào)控15-16
• 1.2.3 Cathelicidins的生物學(xué)功能16-17
• 1.2.4 Cathelicidins在醫(yī)療保健中的應(yīng)用前景17
• 1.2.5 禽cathelicidins的研究進(jìn)展17-19
• 1.3 研究目的意義與研究內(nèi)容19-21
• 1.3.1 研究目的與意義19
• 1.3.2 研究內(nèi)容19-21
• 2 材料與方法21-34
• 2.1 鴨源肽的基因克隆21-26
• 2.1.1 材料21-22
• 2.1.2 組織總RNA的提取22-23
• 2.1.3 cDNA文庫的構(gòu)建23
• 2.1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）23-24
• 2.1.5 PCR產(chǎn)物的回收24
• 2.1.6 PCR產(chǎn)物與T載體連接24
• 2.1.7 連著產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化24-25
• 2.1.8 PCR鑒定陽性重組子25
• 2.1.9 3'RACE巢氏PCR反應(yīng)體系25-26
• 2.2 鴨子抗菌肽的鑒定及結(jié)構(gòu)分析26-27
• 2.2.1 鴨源cathelicidin成熟肽(dCATH)的預(yù)測(cè)26
• 2.2.2 鴨cathelicidin進(jìn)化樹分析26-27
• 2.3 dCATH 的生物學(xué)活性與二級(jí)結(jié)構(gòu)27-30
• 2.3.1 材料27-28
• 2.3.2 肽的合成與溶解28
• 2.3.3 抑菌活性測(cè)定28
• 2.3.4 溶血活性測(cè)定28-29
• 2.3.5 細(xì)胞毒性測(cè)定29
• 2.3.6 穩(wěn)定性29-30
• 2.3.7 圓二色光譜（CD）30
• 2.4 抗菌肽的抑菌機(jī)理30-33
• 2.4.1 材料30-31
• 2.4.2 細(xì)胞膜的完整性與通透性31-32
• 2.4.3 掃描電子顯微鏡的觀察32
• 2.4.4 透射電子顯微鏡觀察32-33
• 2.5 數(shù)據(jù)分析33-34
• 3 結(jié)果與分析34-45
• 3.1 鴨源肽的克隆34-38
• 3.1.1 RNA與PCR產(chǎn)物質(zhì)量檢測(cè)34-35
• 3.1.2 測(cè)序結(jié)果分析及功能序列的確立35-36
• 3.1.3 dCTAH的同源性與進(jìn)化樹分析36-38
• 3.2 肽的活性與二級(jí)結(jié)構(gòu)38-41
• 3.2.1 抑菌活性38
• 3.2.2 肽的溶血與細(xì)胞毒性38-39
• 3.2.3 穩(wěn)定性39-41
• 3.2.4 dCATH的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析41
• 3.3 作用機(jī)理41-45
• 3.3.1 外膜通透性測(cè)定41-42
• 3.3.2 內(nèi)膜通透性與內(nèi)膜去極化42-43
• 3.3.3 掃描與透射43-45
• 4 討論45-50
• 4.1 dCATH序列的確立及進(jìn)化分析45-46
• 4.2 dCATH的生物學(xué)活性與結(jié)構(gòu)46-48
• 4.2.1 抑菌活性46
• 4.2.2 肽結(jié)構(gòu)46
• 4.2.3 肽的毒性46-47
• 4.2.4 穩(wěn)定性47-48
• 4.3 作用機(jī)理48-50
• 4.3.1 膜的通透性與去極化48
• 4.3.2 電鏡觀察48-50
• 5 結(jié)論50-51
• 致謝51-52
• 參考文獻(xiàn)52-60
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文60

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 涂璇;薛秀園;涂國全;;紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌機(jī)制的研究[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);2011年01期

2 趙建平;;魚類乳酸菌的分離及抑菌機(jī)制[J];科學(xué)養(yǎng)魚;2009年11期

3 李娜;;廣譜生防細(xì)菌FW的鑒定及其抑菌機(jī)制的研究[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2009年24期

4 李永剛;郭曉慧;;枯草芽孢桿菌BS2對(duì)葡萄灰霉病菌抑菌機(jī)制的初步探索[J];微生物學(xué)通報(bào);2010年05期

5 ;[J];;年期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 高偉;鴨源cathelicidin的分子克隆及體外生物學(xué)功能研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 師偉;榛花中抑制金黃色葡萄球菌化合物的篩選及抑菌機(jī)制研究[D];遼寧師范大學(xué);2011年

3 周莉君;馬桑抑菌物質(zhì)的分離鑒定及抑菌機(jī)制研究[D];四川大學(xué);2006年

4 董法寶;桑樹內(nèi)生拮抗細(xì)菌Burkholderia cepacia Lu10-1的抑菌機(jī)制及對(duì)家蠶病害的防治效果研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

，

本文編號(hào)：570372