發(fā)布時(shí)間：2017-07-18 14:36

  本文關(guān)鍵詞：伽氏疏螺旋體P66基因的特征與抗原性研究

  更多相關(guān)文章： 伽氏疏螺旋體尚志株 媒介蜱 P66基因 原核表達(dá) Real-time PCR

【摘要】：萊姆病(Lyme disease)是由伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi sensu lato)感染引起的主要經(jīng)蜱傳播的自然疫源性人獸共患病。萊姆病在全世界范圍內(nèi)流行,已經(jīng)成為一種全球性的對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重危害的蟲(chóng)媒傳染病。(1)本研究對(duì)采自8個(gè)省份的849份蜱(5屬,7種)提取全基因組,基于鞭毛蛋白基因(fla)通過(guò)套式PCR(nested polymerase chain reaction)法進(jìn)行伯氏疏螺旋體的檢測(cè)。結(jié)果表明,不同地區(qū)的蜱體內(nèi)均攜帶病原,平均感染陽(yáng)性率為18.4%(156/849,95%CI=12.8-42.5%),在1.8%~77.4%之間。鞭毛蛋白基因序列和系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,有4種基因型的伯氏疏螺旋體病原:伽氏疏螺旋體(B.garinii)、狹義伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi sensu stricto)、阿氏疏螺旋體(B.afzelii)、美洲疏螺旋體(B.americana)以及一個(gè)未定種(Borrelia sp.)存在,并在我國(guó)首次報(bào)道了美洲疏螺旋體(B.americana)。(2)P66是由伯氏疏螺旋體染色體編碼的外膜蛋白,分子量約為66 ku。目前的研究表明,伯氏疏螺旋體P66蛋白主要有兩種功能:一是可作為一種黏附分子,結(jié)合β3整合蛋白;二是可作為外膜孔通道蛋白發(fā)揮作用。本研究根據(jù)已獲得的伽氏疏螺旋體尚志株(B.garinii SZ)的全基因組數(shù)據(jù),克隆P66基因編碼的開(kāi)放閱讀框。結(jié)果顯示,PCR擴(kuò)增獲得P66基因的完整ORF(1866 bp),編碼621個(gè)氨基酸,分子量為68.4 ku。生物信息學(xué)分析顯示,1-21氨基酸為信號(hào)肽序列,二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋和β折疊為主。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,伽氏疏螺旋體尚志株的P66基因與GenBank公布的伽氏疏螺旋體(美國(guó)-PBr株和德國(guó)-Pbi株)分布在同一個(gè)分支上,表明獲得的P66基因是正確的。(3)以上述獲得的P66基因片段為模板,設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增獲得部分P66基因。將目的片段連接表達(dá)載體pET-30a(+),轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21(DE3),經(jīng)PCR、雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證正確后,進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)與純化;將純化的融合蛋白免疫新西蘭大白兔,制備多克隆抗體。SDS-PAGE結(jié)果顯示,獲得約70 ku的表達(dá)產(chǎn)物。Western-blot分析表明表達(dá)產(chǎn)物能夠與抗His標(biāo)簽的小鼠單克隆抗體、螺旋體感染鼠源陽(yáng)性血清、兔抗P66多克隆抗體均能發(fā)生反應(yīng)�？箁P66蛋白的多克隆抗體也可識(shí)別天然蛋白。(4)收集體外培養(yǎng)的伽氏疏螺旋體尚志株的菌液以皮下注射的方式感染BLAB/c小鼠,在感染后不同時(shí)間點(diǎn)收集小鼠臟器,并提取組織總RNA,獲得第一鏈cDNA;設(shè)計(jì)針對(duì)P66基因的Real-time PCR引物,內(nèi)參為鞭毛蛋白(flaB)基因,評(píng)價(jià)P66基因在宿主感染不同階段的表達(dá)豐度。結(jié)果表明,P66基因在感染宿主后不同時(shí)間、不同組織中的表達(dá)變化規(guī)律不明顯,但是腦組織中表達(dá)量的變化較為明顯,間接說(shuō)明P66基因與伽氏疏螺旋體的致病性相關(guān)。以上研究結(jié)果顯示,通過(guò)對(duì)伽氏疏螺旋體尚志株P(guān)66基因的生物信息學(xué)分析,蛋白的克隆及原核表達(dá),制備多克隆抗體,驗(yàn)證了抗體對(duì)天然蛋白的識(shí)別性,以及Real-time PCR對(duì)P66基因在宿主感染后不同階段的表達(dá)豐度變化的評(píng)價(jià),表明P66基因與伽氏疏螺旋體的致病性相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：伽氏疏螺旋體尚志株 媒介蜱 P66基因 原核表達(dá) Real-time PCR
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.63
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-14
• 英文縮略表14-15
• 第一章 引言15-23
• 1.1 病原體15
• 1.2 生活史15-16
• 1.3 流行病學(xué)16-18
• 1.3.1 地理分布16-17
• 1.3.2 傳播媒介17
• 1.3.3 儲(chǔ)存宿主17-18
• 1.4 致病機(jī)制與致病相關(guān)蛋白18-20
• 1.5 臨床癥狀20
• 1.6 診斷方法20-21
• 1.6.1 病原學(xué)檢測(cè)20-21
• 1.6.1.1 病原的直接檢測(cè)20
• 1.6.1.2 病原的分離培養(yǎng)20-21
• 1.6.2 血清學(xué)檢測(cè)21
• 1.6.3 分子生物學(xué)檢測(cè)21
• 1.6.4 新的檢測(cè)方法21
• 1.7 P66基因的研究21-22
• 1.8 研究的目的與意義22-23
• 第二章 我國(guó)部分地區(qū)的蜱體內(nèi)伯氏疏螺旋體的調(diào)查23-33
• 2.1 材料23-24
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株23
• 2.1.2 野外樣品收集23
• 2.1.3 試劑23
• 2.1.4 儀器設(shè)備23-24
• 2.2 方法24-29
• 2.2.1 引物的設(shè)計(jì)和合成24
• 2.2.2 伽氏疏螺旋體尚志株的培養(yǎng)24-25
• 2.2.3 蜱樣品的采集及鑒定25
• 2.2.4 DNA提取25-26
• 2.2.4.1 伽氏疏螺旋體尚志株DNA的提取25-26
• 2.2.4.2 蜱DNA的提取26
• 2.2.5 樣品的PCR檢測(cè)26-27
• 2.2.6 PCR陽(yáng)性產(chǎn)物純化與回收27-28
• 2.2.7 目的基因片段的克隆與測(cè)序28
• 2.2.7.1 目的片段與載體的連接28
• 2.2.7.2 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化28
• 2.2.7.3 挑斑搖菌和檢測(cè)28
• 2.2.8 序列和數(shù)據(jù)分析28-29
• 2.3 結(jié)果29-31
• 2.3.1 蜱體內(nèi)伯氏疏螺旋體的檢測(cè)29
• 2.3.2 序列和系統(tǒng)進(jìn)化分析29-31
• 2.4 討論31-33
• 第三章 伽氏疏螺旋體尚志株P(guān)66基因生物信息學(xué)分析33-44
• 3.1 材料33
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株33
• 3.1.2 試劑33
• 3.1.3 儀器設(shè)備33
• 3.2 方法33-36
• 3.2.1 伽氏疏螺旋體尚志株的培養(yǎng)33
• 3.2.2 伽氏疏螺旋體尚志株總RNA的提取33-34
• 3.2.3 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA34
• 3.2.4 引物的設(shè)計(jì)和合成34-35
• 3.2.5 P66基因全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增35
• 3.2.6 PCR產(chǎn)物膠回收35
• 3.2.7 膠回收產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序35-36
• 3.2.7.1 膠回收產(chǎn)物的連接35-36
• 3.2.7.2 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化36
• 3.2.7.3 挑斑搖菌和檢測(cè)36
• 3.2.8 生物信息學(xué)分析36
• 3.3 結(jié)果36-42
• 3.3.1 伽氏疏螺旋體尚志株P(guān)66基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增36-37
• 3.3.2 伽氏疏螺旋體尚志株P(guān)66基因的進(jìn)化關(guān)系37-38
• 3.3.3 P66蛋白的生理學(xué)和生物化學(xué)特征分析38-40
• 3.3.4 P66蛋白的親/疏水性和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)40
• 3.3.5 P66蛋白的功能域和信號(hào)肽預(yù)測(cè)40-41
• 3.3.6 P66蛋白的B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)41-42
• 3.4 討論42-44
• 第四章 伽氏疏螺旋體尚志株P(guān)66基因的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備44-54
• 4.1 材料44
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物44
• 4.1.2 試劑44
• 4.1.3 儀器設(shè)備44
• 4.2 方法44-48
• 4.2.1 引物的設(shè)計(jì)和合成44-45
• 4.2.2 目的基因PCR擴(kuò)增45
• 4.2.3 PCR產(chǎn)物的目的片段膠回收45
• 4.2.4 膠回收產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序45-46
• 4.2.4.1 膠回收產(chǎn)物的連接45-46
• 4.2.4.2 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化46
• 4.2.4.3 挑斑搖菌和檢測(cè)46
• 4.2.5 質(zhì)粒提取46
• 4.2.6 原核表達(dá)載體的構(gòu)建46-47
• 4.2.6.1 克隆質(zhì)粒與表達(dá)載體的雙酶切46
• 4.2.6.2 目的片段和表達(dá)載體的連接46-47
• 4.2.6.3 轉(zhuǎn)化、挑斑和搖菌47
• 4.2.6.4 重組質(zhì)粒的鑒定47
• 4.2.7 重組質(zhì)粒的的原核表達(dá)47
• 4.2.8 重組蛋白的純化47-48
• 4.2.9 兔源抗體的制備、特異性及抗體效價(jià)的測(cè)定48
• 4.2.10 多克隆抗體對(duì)天然蛋白的識(shí)別48
• 4.3 結(jié)果48-52
• 4.3.1 P66基因的擴(kuò)增48-49
• 4.3.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定49-50
• 4.3.3 重組蛋白的表達(dá)及純化50
• 4.3.4 重組蛋白的免疫原性分析50-51
• 4.3.5 天然蛋白的識(shí)別與鑒定分析51-52
• 4.4 討論52-54
• 第五章 伽氏疏螺旋體尚志株P(guān)66基因在宿主中的差異表達(dá)分析54-62
• 5.1 材料54
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物54
• 5.1.2 試劑54
• 5.1.3 儀器設(shè)備54
• 5.2 方法54-56
• 5.2.1 伽氏疏螺旋體尚志株的培養(yǎng)54
• 5.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)54-55
• 5.2.3 小鼠臟器的收集55
• 5.2.4 組織總RNA的提取55
• 5.2.5 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA55
• 5.2.6 引物設(shè)計(jì)和合成55-56
• 5.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)56
• 5.3 結(jié)果56-60
• 5.3.1 P66基因在同一組織不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)豐度56-58
• 5.3.2 P66基因在同一時(shí)間點(diǎn)不同組織中的表達(dá)豐度58-60
• 5.4 討論60-62
• 第六章 全文結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-69
• 致謝69-70
• 作者簡(jiǎn)歷70

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 曹有祥,張習(xí)坦,馬靜,張永國(guó),錢(qián)金泉,魏國(guó)華;從新疆全溝硬蜱中分離出萊姆病病病原體的報(bào)告[J];地方病通報(bào);1988年04期

，

本文編號(hào)：558209