本文關(guān)鍵詞：原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和傳代的技術(shù)研究

  更多相關(guān)文章： 奶牛 乳腺上皮細(xì)胞 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)

【摘要】：利用動(dòng)物乳腺來(lái)生產(chǎn)藥用蛋白是生物高新技術(shù)中重要的內(nèi)容,對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的探索從未停止。自小鼠轉(zhuǎn)基因起,動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)已經(jīng)漸漸地建立起來(lái)。乳腺上皮細(xì)胞具有分泌性,是一種功能細(xì)胞,乳腺正是依靠該細(xì)胞來(lái)進(jìn)行泌乳。作為乳腺泌乳的基礎(chǔ),乳腺上皮細(xì)胞對(duì)于探究泌乳的啟動(dòng)、功能維持和退化等生理過(guò)程來(lái)說(shuō),是一種必需的材料,沒(méi)有這種材料,無(wú)法研究基因表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)等問(wèn)題。目前,體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞存在一些問(wèn)題,復(fù)雜的過(guò)程和有限的傳代次數(shù)導(dǎo)致成功率不是很高。通常情況下,即使培養(yǎng)成功,乳腺上皮細(xì)胞也會(huì)失去一些生物學(xué)功能,這就使得這些細(xì)胞一般僅能用于科學(xué)研究,利用其進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)等實(shí)際應(yīng)用,難度較大。就國(guó)內(nèi)而言,成功培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的示例不多。即使在成功的實(shí)例中,對(duì)于如何分離、培養(yǎng)和傳代乳腺上皮細(xì)胞,也沒(méi)有一個(gè)比較明確的結(jié)論。由上述背景可以看出,當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題一個(gè)是創(chuàng)立新的方法或者改善現(xiàn)有方法來(lái)有效地分離培養(yǎng)和傳代奶牛乳腺上皮細(xì)胞,另一個(gè)就是建立什么技術(shù)指標(biāo)來(lái)檢測(cè)純化的乳腺上皮細(xì)胞。所以,研究奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、傳代技術(shù)是很有意義的。本文研究選取的實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自于健康的荷斯坦奶牛乳腺組織,使用組織塊接種法體外培養(yǎng)并得到了奶牛乳腺上皮細(xì)胞。并且在成功獲得奶牛乳腺上皮細(xì)胞后,使用了細(xì)胞角蛋白的免疫熒光(IF)染色和蛋白質(zhì)免疫印記(WB)對(duì)乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。通過(guò)對(duì)細(xì)胞在分離、培養(yǎng)、傳代中光學(xué)顯微鏡下的觀察和對(duì)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇方法的研究,建立了清楚的原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法。與此同時(shí),對(duì)用不同方法凍存的奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇,而后測(cè)定了細(xì)胞的貼壁率。除此之外,還檢測(cè)了奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的甘油三酯、乳糖和酪蛋白這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及細(xì)胞的增殖規(guī)律。這些檢測(cè)結(jié)果,從各個(gè)方面體現(xiàn)出了處于不同代數(shù)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳的差異,進(jìn)而為奶牛乳腺上皮細(xì)胞后面的實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)和參考。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過(guò)組織塊貼壁培養(yǎng)法分別分離得到乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)物。對(duì)經(jīng)過(guò)角蛋白的免疫熒光(IF)染色和蛋白質(zhì)免疫印記(WB)鑒定的乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用不同方法凍存的奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇,B組方法(將凍存管放置自制泡沫盒中)凍存后復(fù)蘇效果最好,貼壁率為91.2%。建議使用此方法凍存細(xì)胞。通過(guò)對(duì)不同代數(shù)的乳腺上皮細(xì)胞的乳糖、乳脂、乳蛋白和細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明前十代乳腺上皮細(xì)胞其分泌的乳糖、乳脂、乳蛋白變化不明顯,其中乳糖、乳脂、乳蛋白在第十五代時(shí)分泌減少的很明顯,細(xì)胞增殖在第十二代時(shí)增殖緩慢。確定1-10代奶牛乳腺上皮細(xì)胞可用于體外研究。
【關(guān)鍵詞】：奶牛 乳腺上皮細(xì)胞 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S823
【目錄】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-19
• 1.1 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的研究11-14
• 1.1.1 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)研究的歷史11
• 1.1.2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用11-12
• 1.1.3 動(dòng)物細(xì)胞系的建立12-13
• 1.1.4 動(dòng)物細(xì)胞系的生長(zhǎng)特點(diǎn)與應(yīng)用13
• 1.1.5 動(dòng)物細(xì)胞的低溫保存13-14
• 1.2 乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)的研究進(jìn)展14-16
• 1.2.1 乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)的方法14-15
• 1.2.2 乳腺上皮細(xì)胞的應(yīng)用15
• 1.2.3 影響乳腺上皮細(xì)胞發(fā)育的因素15-16
• 1.2.4 乳腺上皮細(xì)胞的研究進(jìn)展16
• 1.3 乳腺上皮細(xì)胞泌乳和增殖16-18
• 1.3.1 乳蛋白16-17
• 1.3.2 乳脂17
• 1.3.3 乳糖17
• 1.3.4 乳腺上皮細(xì)胞的增殖17-18
• 1.4 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c意義18-19
• 2 材料和方法19-26
• 2.1 實(shí)驗(yàn)主要材料19-20
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑19
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備19-20
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法20-25
• 2.2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)20
• 2.2.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和純化20
• 2.2.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的鑒定20-21
• 2.2.4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)的觀察21
• 2.2.5 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇21-22
• 2.2.6 奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳和增殖22-25
• 2.3 數(shù)據(jù)分析25-26
• 3 結(jié)果與分析26-43
• 3.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)26-28
• 3.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的純化28-31
• 3.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞光學(xué)顯微鏡觀察31-32
• 3.4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的鑒定32-33
• 3.5 奶牛乳腺上皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)33-36
• 3.6 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇36-37
• 3.7 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖37-40
• 3.8 奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳糖含量測(cè)定40-41
• 3.9 奶牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯含量測(cè)定41-42
• 3.10 奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白含量測(cè)定42-43
• 4 討論43-45
• 4.1 原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分離、純化和傳代43
• 4.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的泌乳和增殖43-44
• 4.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇44-45
• 5 結(jié)論45-46
• 致謝46-47
• 參考文獻(xiàn)47-52
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文52

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7 郝明超;劉r，

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