發(fā)布時(shí)間：2017-07-18 01:23

  本文關(guān)鍵詞：2014～2016年?yáng)|營(yíng)及鹽城地區(qū)野鳥(niǎo)與家禽中AIV監(jiān)測(cè)及其遺傳進(jìn)化研究

  更多相關(guān)文章： H9N2亞型AIV H5N1亞型AIV 候鳥(niǎo) 家禽 遺傳多樣性

【摘要】：禽流感,全名鳥(niǎo)禽類(lèi)流行性感冒。禽流感病毒(Avain Influenza Virus,AIV)屬于正粘病毒科流感病毒屬。AIV全基因組由8個(gè)負(fù)鏈的單鏈RAN組成,分別為PB2,PB1,PA,HA,NP,NA,M,和NS基因。目前已發(fā)現(xiàn)16種HA和9種NA,其互相組合形成了多種AIV亞型,如H9N2亞型、H5N1亞型。野鳥(niǎo)被認(rèn)為是AIV的天然宿主,但野鳥(niǎo)攜帶的禽流感病毒一般不直接感染人。近期我國(guó)爆發(fā)的新型H7N9和H10N8禽流感疫情嚴(yán)重威脅公共健康,并給我國(guó)的家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失(Chen et al.,2014)。研究表明,兩者均為低致病性AIV,其HA和NA的來(lái)源均與東亞-澳大利亞遷徙路線(xiàn)上的野鳥(niǎo)有關(guān),而內(nèi)部基因來(lái)自家禽中流行的H9N2亞型AIV。因此,對(duì)我國(guó)遷徙候鳥(niǎo)及其棲息地區(qū)家禽中AIV的監(jiān)測(cè)、對(duì)野鳥(niǎo)和家禽攜帶的AIV的遺傳多樣性、對(duì)不同棲息地間AIV傳播的時(shí)空特征的研究工作具有重要的意義。本研究以入選國(guó)際重要濕地名錄的黃河三角洲(山東東營(yíng))和江蘇鹽城濕地作為東亞-澳大利亞遷徙路徑上的北、南兩個(gè)研究基地,自2014年11月至2016年2月從兩研究基地共進(jìn)行了6次采樣,其中東營(yíng)和鹽城各采樣3次。共采集糞便、拭子等樣本6570份,其中家禽樣本3093份,野鳥(niǎo)樣本3477份。利用AIV通用型引物,Taq Man探針熒光定量PCR(Real-time PCR)方法檢測(cè)樣本中AIV陽(yáng)性率�；钋菔袌�(chǎng)家禽樣本中AIV陽(yáng)性率為8.8%~35.0%(22/250~210/600),野鳥(niǎo)中AIV陽(yáng)性率為0.3%~9.4%(2/688~78/826)。利用普通PCR方法對(duì)Real-time PCR測(cè)得Ct值30的樣本進(jìn)行H5亞型鑒定。將非H5亞型的樣本接種9~11日齡SPF雞胚進(jìn)行病毒分離。H5亞型樣本送往國(guó)家疾控中心微生物所進(jìn)行病毒分離。共分離到29株H9N2、13株H5N1、2株H3N2、2株H5N2和2株H5N1+H3N2的混合感染毒株。其中除3株H9N2分離自鹽城外,其他毒株均來(lái)自東營(yíng)。除3株H9N2分離自東營(yíng)地區(qū)野鳥(niǎo)外,其他均分離自家禽。并利用二代測(cè)序測(cè)得所有毒株的50個(gè)全基因組序列。自東營(yíng)的前兩次采樣中獲得25株AIV毒株。其中H9N2亞型占88%(22/25),H5N1亞型占4%(1/25)。而自東營(yíng)的第三次采樣中獲得的22個(gè)AIV毒株中H9N2亞型占18.2%(4/22),H5N1亞型毒株占63.6%(14/22)。這一數(shù)據(jù)說(shuō)明東營(yíng)地區(qū)的主要流行亞型可能由H9N2轉(zhuǎn)變?yōu)镠5N1亞型。選取上述分離自東營(yíng)的2株野鳥(niǎo)源、20株雞源和鹽城的3株雞源株(共25株)H9N2亞型AIV全基因組,進(jìn)行了分子特征、系統(tǒng)發(fā)育及溯源分析。自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載每個(gè)毒株對(duì)應(yīng)的100條與其親緣關(guān)系最近的序列,用Muscle軟件將參考序列與本研究選取的序列對(duì)齊后,利用RAx ML軟件構(gòu)建基因進(jìn)化樹(shù)。根據(jù)樹(shù)形與Bootstrap值對(duì)8個(gè)基因片段的進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行了組別劃分,并根據(jù)這一劃分,最終將所述的25個(gè)AIV分為九個(gè)新的基因型。22個(gè)分離自東營(yíng)的毒株在這九個(gè)基因型中均有分布,這表明東營(yíng)地區(qū)的H9N2具有高度的遺傳多樣性,說(shuō)明它們可能經(jīng)歷了頻繁的基因重配。此外,基因型6中的毒株內(nèi)部基因除一個(gè)毒株的PB2基因外其他均與基因型1(由分離自東營(yíng)的兩野鳥(niǎo)株組成)中的相同。這一證據(jù)可能暗示了病毒在野鳥(niǎo)與家禽之間的傳播。選取自東營(yíng)某養(yǎng)鴨場(chǎng)分離到一株鴨源H5N1亞型AIV,將該毒株命名為A/Duck/Shandong/1-14/2014(H5N1),用以研究我國(guó)流行的H5N1高致病性AIV的進(jìn)化與傳播。對(duì)病毒HA基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析表明其屬于2.3.2.1c家系。根據(jù)其他基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn),除了PB2基因來(lái)自于H9N2亞型外,其余7個(gè)基因均來(lái)自于H5N1。該毒株與北美首例人感染H5N1和造成2015年1月河南三門(mén)峽野鳥(niǎo)疫情的毒株屬于同一個(gè)基因型,為2.3.2.1c中一個(gè)新近報(bào)道的基因型。并且該基因型病毒于不同時(shí)間點(diǎn)在我國(guó)的北京、山東和河南等地的家禽和野鳥(niǎo)中出現(xiàn),表明其已具備了一定的適應(yīng)性并在持續(xù)傳播。尚未發(fā)現(xiàn)該基因型的毒株在關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異。本研究為2014年11月至2016年2月在我國(guó)東部地區(qū)遷徙候鳥(niǎo)和當(dāng)?shù)丶仪葜蠥IV流行情況提供了重要的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù),證明了沿東亞-澳大利亞遷徙路線(xiàn)AIV的高遺傳多樣性。將預(yù)防人感染低致病性禽流感提前到野鳥(niǎo)-家禽窗口,對(duì)潛在的感染人的AIV進(jìn)行提前預(yù)警。
【關(guān)鍵詞】：H9N2亞型AIV H5N1亞型AIV 候鳥(niǎo) 家禽 遺傳多樣性
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S855.3
【目錄】：

• 符號(hào)說(shuō)明5-9
• 中文摘要9-11
• ABSTRACT11-14
• 1 前言14-24
• 1.1 流感概述14-16
• 1.1.1 禽流感病毒基因組成14-15
• 1.1.2 禽流感病毒株命名原則15
• 1.1.3 禽流感病毒危害15-16
• 1.2 候鳥(niǎo)遷徙16-18
• 1.3 候鳥(niǎo)與家禽攜帶的禽流感病毒18-19
• 1.4 近期我國(guó)感染人的禽流感病毒的溯源19
• 1.5 H9N2亞型禽流感19-22
• 1.5.1 H9N2亞型禽流感的流行現(xiàn)狀20
• 1.5.2 野鳥(niǎo)中H9N2亞型禽流感病毒20
• 1.5.3 家禽中H9N2亞型禽流感病毒20-21
• 1.5.4 H9N2亞型禽流感病毒基因的進(jìn)化21-22
• 1.6 H5N1亞型禽流感22-23
• 1.6.1 H5N1亞型AIV的流行現(xiàn)狀22
• 1.6.2 H5N1亞型AIV的基因進(jìn)化22-23
• 1.7 本研究的意義23-24
• 2 材料方法24-35
• 2.1 試驗(yàn)材料24-26
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑24
• 2.1.2 個(gè)人防護(hù)裝備24
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)耗材24-25
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器25-26
• 2.2 試驗(yàn)方法26-35
• 2.2.1 采樣物品準(zhǔn)備26
• 2.2.2 樣本采集26-27
• 2.2.3 樣本處理27-28
• 2.2.4 樣本中RNA的提取28-29
• 2.2.5 CDNA合成29
• 2.2.6 熒光定量PCR檢測(cè)29-31
• 2.2.7 病毒亞型測(cè)定31-32
• 2.2.8 病毒分離32-33
• 2.2.9 增殖后病毒載量測(cè)定33-34
• 2.2.10 病毒全基因組測(cè)定34
• 2.2.11 系統(tǒng)發(fā)生分析34-35
• 2.2.12 分子特征分析35
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-54
• 3.1 2014 年~2016 年?yáng)|營(yíng)與鹽城兩地野鳥(niǎo)與家禽AIV流行病學(xué)調(diào)查與研究35-43
• 3.1.1 樣本采集背景與數(shù)量35-36
• 3.1.2 野鳥(niǎo)與活禽市場(chǎng)家禽中甲型流感陽(yáng)性率檢測(cè)36-38
• 3.1.3 東營(yíng)與鹽城AIV陽(yáng)性樣本分離到毒株分析38-43
• 3.2 2014.11-2015.3 東營(yíng)與鹽城兩地野鳥(niǎo)與家禽中分離的H9N2禽流感毒株系統(tǒng)發(fā)生分析43-50
• 3.2.1 基因進(jìn)化樹(shù)分析43-50
• 3.3 2014 年自東營(yíng)某養(yǎng)鴨場(chǎng)獲得的一株H5N1亞型禽流感毒株分子特征與系統(tǒng)發(fā)育分析50-54
• 3.3.1 熒光定量PCR鑒定及PCR分型50
• 3.3.2 系統(tǒng)發(fā)育分析50-51
• 3.3.3 分子特征分析51-54
• 4 討論54-56
• 4.1 2014 年~2016 年?yáng)|營(yíng)與鹽城兩地野鳥(niǎo)與家禽AIV流行病學(xué)調(diào)查與研究54-55
• 4.2 2014.11-2015.3 東營(yíng)與鹽城兩地野鳥(niǎo)與家禽中分離的H9N2禽流感毒株系統(tǒng)發(fā)生分析55
• 4.3 2014 年自東營(yíng)某養(yǎng)鴨場(chǎng)獲得的一株H5N1亞型禽流感毒株分子特征與系統(tǒng)發(fā)育分析55-56
• 5 結(jié)論56-58
• 5.1 2014 年~2016 年?yáng)|營(yíng)與鹽城兩地野鳥(niǎo)與家禽AIV流行病學(xué)調(diào)查與研究56-57
• 5.2 2014.11-2015.3 東營(yíng)與鹽城兩地野鳥(niǎo)與家禽中分離的H9N2禽流感毒株系統(tǒng)發(fā)生分析57
• 5.3 2014 年自東營(yíng)某養(yǎng)鴨場(chǎng)獲得的一株H5N1亞型禽流感毒株分子特征與系統(tǒng)發(fā)育分析57-58
• 參考文獻(xiàn)58-65
• 致謝65-66
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況66

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 祝相梅;秦海波;;禽流感(AIV)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法[J];養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn);2011年09期

2 李暉;余興龍;王霞;;湘西散養(yǎng)型家鴨H5、H7亞型AIV抗體水平檢測(cè)與分析[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2011年23期

3 ;[J];;年期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 高雪麗;鄭世民;劉明;劉超男;;AIV感染雛雞免疫器官淋巴細(xì)胞增殖功能變化[A];2008年中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)第十一屆腫瘤和第十二屆免疫專(zhuān)業(yè)委員會(huì)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2008年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 劉濤;基于A(yíng)IV的3D手機(jī)立體圖像合成算法及虛擬視點(diǎn)合成算法研究[D];天津大學(xué);2014年

2 王衛(wèi)華;高表達(dá)耐熱鏈霉菌acyB基因及其固定化發(fā)酵生產(chǎn)AIV研究[D];天津大學(xué);2014年

3 王海明;2014～2016年?yáng)|營(yíng)及鹽城地區(qū)野鳥(niǎo)與家禽中AIV監(jiān)測(cè)及其遺傳進(jìn)化研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

，

本文編號(hào)：555439