本文關(guān)鍵詞：ZEA、DON及其聯(lián)合染毒誘導(dǎo)CTLL-2細(xì)胞凋亡及信號途徑研究

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【摘要】：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)和玉米赤霉烯酮(Z earalenone, ZEA)是飼料中兩種最常見的霉菌毒素。ZEA和DON可降低飼料的營養(yǎng)價值,導(dǎo)致動物生長性能和繁殖性能下降,還具有免疫抑制作用,可導(dǎo)致畜禽對疫病的抵抗力大大下降。目前,人們并沒有完全搞清ZEA和DON免疫毒性作用及其機(jī)理。另外,自然情況下,ZEA和DON在飼料中的常共同存在,研究它們對畜禽造成的聯(lián)合免疫毒性作用及其機(jī)理對ZEA和DON中毒的防控更具有指導(dǎo)意義,特別是可以為飼料中這兩種霉菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。為揭示ZEA和DON及其聯(lián)合作用的免疫毒性和分子機(jī)理,本研究以CTLL-2細(xì)胞(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞株)為材料,進(jìn)行了不同濃度的ZEA、DON及聯(lián)合染毒試驗,利用CCK-8法、酶聯(lián)免疫吸附法、流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡法等技術(shù)檢測了細(xì)胞毒性、免疫相關(guān)細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)信號蛋白表達(dá)等變化情況。1.DON、ZEA對CTLL-2細(xì)胞毒性作用及聯(lián)合染毒濃度確定。用不同濃度的ZEA(0、2.5、5、10、20、40μg/mL)、DON (0、0.25、0.5、1、2、4μg/mL)處理CTLL-2細(xì)胞48h。用CCK-8法檢測不同濃度的DON、ZE A對CTLL-2細(xì)胞的細(xì)胞活力的影響。結(jié)果表明,隨著ZEA、DON濃度的升高,CTLL-2細(xì)胞的細(xì)胞活力下降,與對照組相比,0.25μg/mL DON染毒組差異不顯著,0.5μg/mL及以上DON染毒組差異極顯著(P0.01)；與對照組相比,ZEA染毒組均有顯著性差異或極顯著性差異(P0.05或P0.01)；與對照組相比,0.25μg/mL DON+2.5μg/mL ZEA及以上聯(lián)合染毒組細(xì)胞活力下降(P0.01)。根據(jù)CCK-8法檢測結(jié)果并參考相關(guān)文獻(xiàn),設(shè)定0.5 μg/mL DON+5 μg/mL ZEA為ZEA、DON聯(lián)合染毒濃度。2.ZEA、DON及其聯(lián)合染毒對CTLL-2細(xì)胞PFP等相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響。用不同濃度的ZEA (0、5、10、20μg/mL)、DON (0、0.5、1、2μg/mL)及聯(lián)合(空白組、5μg/mL ZEA、0.5μg/mL DON、5μg/mL ZEA 和 0.5μg/mL DON)處理CTLL-2細(xì)胞48h。用酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)上清液中顆粒酶B(GZMB)、穿孔素(PFP)、干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的濃度。結(jié)果表明,ZEA、DON能夠抑制CTLL-2細(xì)胞胞內(nèi)及培養(yǎng)上清液中PFP、GZMB、IFN-y的表達(dá),呈劑量-效應(yīng)關(guān)系：隨著ZEA、DON濃度的升高,細(xì)胞胞內(nèi)及培養(yǎng)上清液中的TNF-a濃度表達(dá)量也逐漸升高,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系；ZEA、 DON聯(lián)合染毒表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。3.ZEA、DON及其聯(lián)合染毒對CTLL-2細(xì)胞凋亡的影響。用不同濃度的ZEA(0、5、10、20μg/mL)、DON (0、0.5、1、2μg/mL)及聯(lián)合(空白組、5μg/mL ZEA、0.5μg/mL DON、5μg/mL ZEA和0.5 μg/mL DON)處理CTLL-2細(xì)胞48 h,用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的影響；20 μg/mL的ZEA和2μg/mL的DON分別處理CTLL-2細(xì)胞48h, DAPI染色法觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化。結(jié)果表明,隨著ZEA、DON濃度的增加,CTLL-2細(xì)胞的凋亡率呈上升趨勢,較對照組有顯著或極顯著差異(P0.05或P0.01),ZEA和DON聯(lián)合染毒為協(xié)同效應(yīng)；DAPI染色結(jié)果顯示,ZEA、DON處理組部分細(xì)胞有凋亡的細(xì)胞核形態(tài)特征,如細(xì)胞核體積縮小,染色質(zhì)凝聚,核固縮成新月體,部分細(xì)胞核呈碎塊狀致密熒光。4.ZEA、DON及其聯(lián)合染毒誘導(dǎo)CTLL-2細(xì)胞凋亡通路的研究。用不同濃度的ZEA(0、5、10、20μg/mL)、DON (0、0.5、1、2μg/mL)及聯(lián)合(空白組、5 μg/mL ZEA、0.5 μg/mL DON、5 μg/mL ZEA和0.5 μ/mL DON)處理CTLL-2細(xì)胞48 h。用免疫印記法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)通路蛋白的表達(dá)情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測ZEA、DON與FasL中和抗體共處理后細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明,各染毒組p53蛋白表達(dá)量較對照組有顯著性或極顯著差異(P0.05或P0.01);隨著ZEA、DON濃度的升高,Bax/Bcl-2的比值升高,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,ZEA與DON聯(lián)合染毒表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。ZEA、DON促進(jìn)細(xì)胞色素c從線粒體中釋放到胞漿中,能夠上調(diào)Cleaved-Caspase 9、Cleaved-Caspase 3的表達(dá),均較對照組有顯著性或極顯著差異(P0.05或P0.01)；FasL、Fas、Cleaved-Caspase8蛋白表達(dá)量隨著ZEA、DON濃度的升高逐漸增加,均較對照組有顯著性或極顯著差異(P0.05或P0.01),與ZEA、DON處理組相比,FasL中和抗體與ZEA、DON共同處理組細(xì)胞凋亡率明顯下降(P0.01);隨著ZEA、DON濃度的升高,p38 MAPK、JNK、Erk的磷酸化水平也升高,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系；ZEA與DON聯(lián)合染毒組,與對照組相比,Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 8、 Cleaved-Caspase 9蛋白的表達(dá)量均上升,呈極顯著差異(P0.01),相比較ZEA、DON單獨(dú)染毒組,ZEA、DON聯(lián)合染毒為協(xié)同效應(yīng)。結(jié)論,ZEA、DON對CTLL-2細(xì)胞有毒性作用,可以抑制CTLL-2細(xì)胞的增殖,ZEA、DON可以抑制C TLL-2細(xì)胞有關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá),降低CTLL-2細(xì)胞殺傷活力。ZEA、DON可以誘導(dǎo)CTLL-2細(xì)胞發(fā)生凋亡,激活CTLL-2細(xì)胞線粒體通路、MAPKs通路,ZEA、DON通過死亡受體途徑誘導(dǎo)CTLL-2細(xì)胞凋亡。ZEA、DON聯(lián)合染毒表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：玉米赤霉烯酮 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 細(xì)胞因子 CTLL-2細(xì)胞 凋亡通路
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S859.8
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 縮略語表10-11
• 上篇 文獻(xiàn)綜述11-22
• 1 玉米赤霉烯酮研究進(jìn)展11-14
• 2 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇研究進(jìn)展14-17
• 3 DON與ZEA聯(lián)合毒性作用研究進(jìn)展17-18
• 4 細(xì)胞毒性T細(xì)胞的免疫功能研究進(jìn)展18-20
• 5 研究目的和意義20-22
• 下篇 實驗部分22-64
• 第一章 DON、ZEA對CTLL-2細(xì)胞的毒性作用及聯(lián)合染毒濃度確定22-27
• 1 材料與方法22-24
• 2 結(jié)果24-25
• 3 討論25-27
• 第二章 ZEA、DON及其聯(lián)合染毒對CTLL-2細(xì)胞PFP等細(xì)胞因子分泌的影響27-39
• 1 材料與方法27-30
• 2 結(jié)果30-37
• 3 討論37-39
• 第三章 ZEA、DON及其聯(lián)合染毒對CTLL-2細(xì)胞凋亡的影響39-46
• 1 材料與方法39-41
• 2 結(jié)果41-44
• 3 討論44-46
• 第四章 ZEA、DON及其聯(lián)合染毒誘導(dǎo)CTLL-2細(xì)胞凋亡通路的研究46-64
• 1 材料與方法46-49
• 2 結(jié)果49-60
• 3 討論60-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-71
• 致謝71-72
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文、論著72-73

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 潘順葉;ZEA、DON及其聯(lián)合染毒誘導(dǎo)CTLL-2細(xì)胞凋亡及信號途徑研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2016年

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本文編號：535770