本文關(guān)鍵詞：飼料添加劑共軛亞油酸生物合成研究

  更多相關(guān)文章： 共軛亞油酸CLA 亞油酸異構(gòu)酶PAI 固定化 雙酶聯(lián)用

【摘要】：共軛亞油酸(Conjugated Linoleic Acid,CLA)是一種人體自身無法合成但是具有重要的保健作用和營養(yǎng)價值的一種脂肪酸,近年來利用實(shí)驗(yàn)動物對其生理功能做了廣泛的研究,包括抗腫瘤、減肥、提高免疫力等生理功能。CLA也是非常有應(yīng)用前景的飼料添加劑,能夠增加動物肌肉組織,減少脂肪含量；生產(chǎn)富含CLA的動物產(chǎn)品如牛奶、禽蛋等；提高動物免疫力,減少抗生素的使用。自然界存在的共軛亞油酸只在反芻動物肉、奶、及其制品中找到,且含量有限。化學(xué)生產(chǎn)方法產(chǎn)物不單一,而且混有副產(chǎn)物。因此本實(shí)驗(yàn)希望通過生物方法得到一種生物酶,可以在適宜的條件下催化富含亞油酸的紅花籽油得到共軛亞油酸,為大規(guī)模生產(chǎn)CLA用于飼料添加劑提供基礎(chǔ)。本研究共分為以下三個部分：共軛亞油酸檢測方法建立。一是分光光度計法,利用共軛亞油酸的共軛雙鍵在233nm下有吸收值,而亞油酸沒有；另一種是氣相色譜(氣質(zhì)聯(lián)用)法,根據(jù)脂肪酸鏈的長度和不飽和度進(jìn)行分離。菌株的構(gòu)建和發(fā)酵條件探索；通過查找蛋白晶體結(jié)構(gòu),找到了一種來源于痤瘡丙酸桿菌的可以生產(chǎn)單一共軛亞油酸(trans-10,cis-12 CLA)的亞油酸異構(gòu)酶,酶基因由上海捷瑞公司合成,選用大腸桿菌作為轉(zhuǎn)化子,通過構(gòu)建載體和轉(zhuǎn)化體,獲得了一種可以生產(chǎn)單一結(jié)構(gòu)的共軛亞油酸的大腸桿菌。通過亞油酸異構(gòu)酶的發(fā)酵條件研究,確定了發(fā)酵底物濃度為1%o LA和1‰輔酶FAD。最適反應(yīng)溫度在40℃左右,pH6.7左右,在此條件下亞油酸異構(gòu)酶保持最高的活性；雙酶聯(lián)用催化體系的建立和細(xì)胞的固定化：以紅花籽油作為底物,8種候選脂肪酶與實(shí)驗(yàn)二獲得的亞油酸異構(gòu)酶建立雙酶聯(lián)用體系,以共軛亞油酸產(chǎn)率為選擇指標(biāo),選出2種理想的脂肪酶用于后續(xù)反應(yīng)。通過固定化表達(dá)亞油酸異構(gòu)酶重組細(xì)胞,固定化細(xì)胞的重復(fù)次數(shù)達(dá)到9次以上,共軛亞油酸的產(chǎn)率達(dá)到39%以上,產(chǎn)物的純度達(dá)到99%以上,該技術(shù)具有工業(yè)應(yīng)用的前景。
【關(guān)鍵詞】：共軛亞油酸CLA 亞油酸異構(gòu)酶PAI 固定化 雙酶聯(lián)用
【學(xué)位授予單位】：杭州師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S816.7
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-18
• 1.1 共軛亞油酸主要生理功能11-12
• 1.2 國內(nèi)外共軛亞油酸種來源的研究現(xiàn)狀12-14
• 1.2.1 共軛亞油酸天然食物來源12
• 1.2.2 化學(xué)法制備共軛亞油酸12
• 1.2.3 CLA的生物合成12-14
• 1.3 脂肪酶與亞油酸異構(gòu)酶雙酶體系生產(chǎn)CLA14-15
• 1.4 固定化酶和固定化細(xì)胞15-16
• 1.5 本課題的研究內(nèi)容16-18
• 第二章 CLA檢測方法建立18-24
• 2.0 前言18
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器18-19
• 2.1.1 試劑及器材18-19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-20
• 2.2.1 分光光度計檢測法檢測19
• 2.2.2 GC-MS法檢測19-20
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-23
• 2.3.1 分光光度計法檢測20
• 2.3.2 GC-MS法檢測20-23
• 2.4 本章小結(jié)23-24
• 第三章 共軛亞油酸的原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建24-38
• 3.1 引言24-25
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器25-27
• 3.2.1 基因和菌種25
• 3.2.2 試劑及器材25-26
• 3.2.3 溶液與培養(yǎng)基26-27
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法27-30
• 3.3.1 共軛亞油酸異構(gòu)酶基因的獲得27
• 3.3.2 構(gòu)建工程菌27
• 3.3.3 優(yōu)化重組酶表達(dá)的誘導(dǎo)條件27-28
• 3.3.4 Ni+柱純化初步純化重組蛋白28
• 3.3.5 重組酶反應(yīng)最適溫度的探索28-29
• 3.3.6 重組酶反應(yīng)最適pH的探索29
• 3.3.7 在最適反應(yīng)條件下檢測重組酶的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率29-30
• 3.4 結(jié)果與討論30-36
• 3.4.1 優(yōu)化重組酶表達(dá)的誘導(dǎo)條件30-31
• 3.4.2 Ni+柱純化初步純化重組蛋白31-32
• 3.4.3 重組酶反應(yīng)最適溫度的探索32-33
• 3.4.4 重組酶反應(yīng)最適pH的探索33-34
• 3.4.5 在最適反應(yīng)條件下檢測重組酶的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率34-36
• 3.5 本章小結(jié)36-38
• 第四章 共軛亞油酸的酶法合成工藝研究38-49
• 4.1 引言38-39
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器39-40
• 4.2.1 菌種39
• 4.2.2 試劑及器材39-40
• 4.2.3 溶液與培養(yǎng)基40
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法40-43
• 4.3.1 重組PAI酶液制備40
• 4.3.2 脂肪酶酶活的測定方法40-41
• 4.3.3 脂肪酶CAL-B和共軛亞油酸異構(gòu)酶PAI的共表達(dá)41
• 4.3.4 篩選脂肪酶,優(yōu)化反應(yīng)體系41-42
• 4.3.5 固定化PAI酶42-43
• 4.3.6 固定化PAI細(xì)胞43
• 4.3.7 雙酶聯(lián)用體系生產(chǎn)共軛亞油酸43
• 4.4 結(jié)果與討論43-48
• 4.4.1 共表達(dá)菌株酶活力的檢測43-45
• 4.4.2 篩選脂肪酶45-46
• 4.4.3 固定化PAI酶46-47
• 4.4.4 固定化細(xì)胞47-48
• 4.4.5 雙酶聯(lián)用體系生產(chǎn)共軛亞油酸48
• 4.5 本章小結(jié)48-49
• 第五章 結(jié)論與展望49-50
• 5.1 結(jié)論49
• 5.2 展望49-50
• 參考文獻(xiàn)50-55

【相似文獻(xiàn)】

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