本文關鍵詞：華南部分地區(qū)PRRSV流行病學調查及Nsp1α和Nsp1β的原核表達

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【摘要】：為了了解華南地區(qū)PRRSV的遺傳變異情況及抗體水平,本實驗對2014-2015年間收集的華南部分地區(qū)的豬血清和病料分別進行PRRSV抗體和抗原的檢測,檢測結果表明:2014共采集5046份豬血清,其中PRRSV抗體陽性血清為4195份,陽性率為83.13%(4195/5046);95%置信區(qū)間為82.67%-83.59%;2015年共采集5531份血清,經檢測PRRSV陽性血清共3992份,陽性率為72.18%(3992/5531),95%置信區(qū)間為70.38%-72.4%;2014年共采集病料583份,其中PRRSV檢測為陽性的樣本為192份,陽性率為33.01%(192/583),95%置信區(qū)間為32.78%-33.23%;2015年共采集病料964份,PRRSV檢測陽性的樣本數(shù)為356,陽性率為36.88%(356/964),95%置信區(qū)間為36.56%-37.2%,與2014年比較,2015年檢測的PRRSV抗體陽性率有所下降而抗原的陽性率有所上升。研究又對PRRSV陽性樣本進行Nsp2和GP5基因的擴增,成功地獲得31條Nsp2序列和64個GP5序列,分析比對Nsp2和GP5基因的氨基酸序列后發(fā)現(xiàn):其中26株PRRSV的Nsp2基因依然是29+1個氨基酸缺失,但也存在著其他形式的氨基酸位點的缺失。與參考毒株相比,GP5基因存在著廣泛的氨基酸位點的突變,主要的突變區(qū)域為信號肽區(qū)、第一高變區(qū)以及第二高變區(qū)。GP5的遺傳進化樹結果表明:華南地區(qū)同時存在著歐洲型和北美型PRRSV,北美型PRRSV進一步分為6個亞群,華南地區(qū)主要流行的亞群是以JXA1為代表的Subgenotype I亞群和以GM2為代表的Subgenotype VI亞群,近幾年新出現(xiàn)的NADC30-like亞群毒株在華南地區(qū)也有出現(xiàn)。分離、鑒定了10株PRRSV,10株PRRSV相互之間的核苷酸同源性為92.6%-97.5%,與JXA1、VR2332及CH-1R毒株的核苷酸同源性分別為95.3%-98.9%、87.8%-89.15%、91.5%-94.9%�；谌蚪M的遺傳進化樹結果顯示10株PRRSV除FJXM毒株屬于過渡亞群Intermediate subgroup外,其余均屬于以JXA1為代表的JXA1-like亞群,彼此之間的親緣關系較為密切。與參考毒株相比,部分毒株的GP3、GP5、GP6蛋白的抗原位點發(fā)生了氨基酸位點的突變。研究還對PRRSV的Nsp1α及Nsp1β基因進行擴增,將其連接到pET-28a表達載體后轉化BL21感受態(tài),經Western blot驗證Nsp1α及Nsp1β蛋白得到了成功表達。為后續(xù)研究Nsp1α及Nsp1β蛋白的功能奠定了基礎。
【關鍵詞】：豬繁殖與呼吸綜合征 ORF5 Nsp2 非結構蛋白 原核表達
【學位授予單位】：華南農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 英文縮寫對照表6-11
• 1 前言11-20
• 1.1 PRRSV病原學11-15
• 1.1.1 PRRSV的分類地位及基因組結構11
• 1.1.2 PRRSV的形態(tài)結構及理化性質11-12
• 1.1.3 PRRSV的結構和非結構蛋白12-14
• 1.1.4 PRRSV的非結構蛋白14-15
• 1.1.5 PRRSV的基因分型15
• 1.2 PRRSV的流行病學特征15-17
• 1.2.1 PRRSV的宿主及臨床癥狀15-16
• 1.2.2 PRRSV的病理變化16
• 1.2.3 PRRSV的傳播途徑16
• 1.2.4 PRRSV的疫苗與防控措施16-17
• 1.3 PRRSV的遺傳變異17-18
• 1.3.1 RNA病毒的復制特性17
• 1.3.2 準種現(xiàn)象17-18
• 1.3.3 基因重組18
• 1.4 本研究的目的與意義18-20
• 2 材料與方法20-34
• 2.1 病毒、菌株、載體及細胞20
• 2.2 細胞培養(yǎng)相關試劑20
• 2.3 工具酶、試劑盒及主要的分子生物學試劑20-21
• 2.4 檢測樣品21
• 2.5 儀器設備21
• 2.6 PRRSV血清抗體的檢測21-22
• 2.7 引物的設計與合成22-23
• 2.8 樣品的RT-PCR檢測23-27
• 2.8.1 總RNA的提取23-24
• 2.8.2 cDNA的合成24
• 2.8.3 PCR擴增24-25
• 2.8.4 PCR回收產物與載體連接25
• 2.8.5 感受態(tài)細胞的制備25
• 2.8.6 連接產物轉化感受態(tài)細胞25
• 2.8.7 PCR鑒定陽性菌液25
• 2.8.8 ORF5及部分Nsp2基因測序結果分析25-27
• 2.9 病毒的分離與鑒定27-29
• 2.9.1 病毒的分離27
• 2.9.2 分離病毒的PCR鑒定27
• 2.9.3 分離病毒的間接免疫熒光鑒定27-28
• 2.9.4 分離病毒的全基因組測序28
• 2.9.5 分離病毒的全基因組序列分析28-29
• 2.10 PRRSV Nsp1α及Nsp1β的原核表達29-34
• 2.10.1 Nsp1α及Nsp1β的擴增29
• 2.10.2 PCR擴增產物的純化29
• 2.10.3 目的片段與載體的雙酶切29-30
• 2.10.4 目的片段與載體的連接30
• 2.10.5 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備30
• 2.10.6 重組質粒的轉化30
• 2.10.7 重組質粒的抽提30-31
• 2.10.8 重組質粒的酶切鑒定31
• 2.10.9 重組質粒序列的測定31
• 2.10.10 重組質粒轉化感受態(tài)細胞31
• 2.10.11 重組蛋白的誘導表達及可溶性分析31
• 2.10.12 重組蛋白SDS-PAGE鑒定31-32
• 2.10.13 重組蛋白最佳誘導時間的確定32
• 2.10.14 重組蛋白最佳IPTG誘導濃度的確定32
• 2.10.15 重組蛋白Western-Blot鑒定32-34
• 3 結果34-53
• 3.1 2014-2015年華南部分地區(qū)PRRSV抗體檢測結果34
• 3.2 2014-2015年華南部分地區(qū)PRRSV抗原檢測結果34-35
• 3.3 2014-2015年部分Nsp2基因氨基酸比對分析35-36
• 3.4 2014-2015年GP5基因遺傳進化分析36-38
• 3.5 2014-2015年GP5基因氨基酸同源性分析38
• 3.6 2014-2015年GP5基因氨基酸突變位點分析38-41
• 3.7 歐洲型PRRSV GP5遺傳進化及突變分析41-42
• 3.8 病毒的分離鑒定42
• 3.9 PRRSV全基因組的擴增42-43
• 3.10 PRRSV全基因組的遺傳進化分析43-45
• 3.11 分離毒株全基因組的同源性分析45-47
• 3.12 分離毒株Nsp2及GP3/GP5/GP6基因氨基酸突變位點分析47-48
• 3.13 分離毒株Nsp9/Nsp10基因氨基酸突變位點分析48
• 3.14 Nsp1α及Nsp1β的擴增48-49
• 3.15 重組質粒的酶切鑒定49
• 3.16 重組質粒的表達與可溶性分析49-50
• 3.17 重組蛋白的最佳誘導時間的確定50-51
• 3.18 重組蛋白的最佳IPTG誘導濃度的確定51-52
• 3.19 重組蛋白Western-blot鑒定52-53
• 4 討論53-56
• 4.1 2014-2015年華南部分地區(qū)PRRSV抗體和抗原的檢測53
• 4.2 Nsp2和GP5基因遺傳進化與變異分析53-54
• 4.3 PRRSV的分離鑒定及全基因組序列分析54-55
• 4.4 PRRSV Nsp1α和Nsp1β的原核表達55-56
• 5 全文總結56-57
• 致謝57-58
• 參考文獻58-70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 李冰;劉麗穎;王輝暖;周鐵忠;;歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染仔豬病理學特征及其組織內病毒分布[J];動物醫(yī)學進展;2015年07期

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本文編號：532513