本文關(guān)鍵詞：華南部分地區(qū)PRRSV流行病學(xué)調(diào)查及Nsp1α和Nsp1β的原核表達(dá)

  更多相關(guān)文章： 豬繁殖與呼吸綜合征 ORF5 Nsp2 非結(jié)構(gòu)蛋白 原核表達(dá)

【摘要】：為了了解華南地區(qū)PRRSV的遺傳變異情況及抗體水平,本實驗對2014-2015年間收集的華南部分地區(qū)的豬血清和病料分別進(jìn)行PRRSV抗體和抗原的檢測,檢測結(jié)果表明:2014共采集5046份豬血清,其中PRRSV抗體陽性血清為4195份,陽性率為83.13%(4195/5046);95%置信區(qū)間為82.67%-83.59%;2015年共采集5531份血清,經(jīng)檢測PRRSV陽性血清共3992份,陽性率為72.18%(3992/5531),95%置信區(qū)間為70.38%-72.4%;2014年共采集病料583份,其中PRRSV檢測為陽性的樣本為192份,陽性率為33.01%(192/583),95%置信區(qū)間為32.78%-33.23%;2015年共采集病料964份,PRRSV檢測陽性的樣本數(shù)為356,陽性率為36.88%(356/964),95%置信區(qū)間為36.56%-37.2%,與2014年比較,2015年檢測的PRRSV抗體陽性率有所下降而抗原的陽性率有所上升。研究又對PRRSV陽性樣本進(jìn)行Nsp2和GP5基因的擴增,成功地獲得31條Nsp2序列和64個GP5序列,分析比對Nsp2和GP5基因的氨基酸序列后發(fā)現(xiàn):其中26株P(guān)RRSV的Nsp2基因依然是29+1個氨基酸缺失,但也存在著其他形式的氨基酸位點的缺失。與參考毒株相比,GP5基因存在著廣泛的氨基酸位點的突變,主要的突變區(qū)域為信號肽區(qū)、第一高變區(qū)以及第二高變區(qū)。GP5的遺傳進(jìn)化樹結(jié)果表明:華南地區(qū)同時存在著歐洲型和北美型PRRSV,北美型PRRSV進(jìn)一步分為6個亞群,華南地區(qū)主要流行的亞群是以JXA1為代表的Subgenotype I亞群和以GM2為代表的Subgenotype VI亞群,近幾年新出現(xiàn)的NADC30-like亞群毒株在華南地區(qū)也有出現(xiàn)。分離、鑒定了10株P(guān)RRSV,10株P(guān)RRSV相互之間的核苷酸同源性為92.6%-97.5%,與JXA1、VR2332及CH-1R毒株的核苷酸同源性分別為95.3%-98.9%、87.8%-89.15%、91.5%-94.9%�；谌蚪M的遺傳進(jìn)化樹結(jié)果顯示10株P(guān)RRSV除FJXM毒株屬于過渡亞群Intermediate subgroup外,其余均屬于以JXA1為代表的JXA1-like亞群,彼此之間的親緣關(guān)系較為密切。與參考毒株相比,部分毒株的GP3、GP5、GP6蛋白的抗原位點發(fā)生了氨基酸位點的突變。研究還對PRRSV的Nsp1α及Nsp1β基因進(jìn)行擴增,將其連接到pET-28a表達(dá)載體后轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài),經(jīng)Western blot驗證Nsp1α及Nsp1β蛋白得到了成功表達(dá)。為后續(xù)研究Nsp1α及Nsp1β蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬繁殖與呼吸綜合征 ORF5 Nsp2 非結(jié)構(gòu)蛋白 原核表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 英文縮寫對照表6-11
• 1 前言11-20
• 1.1 PRRSV病原學(xué)11-15
• 1.1.1 PRRSV的分類地位及基因組結(jié)構(gòu)11
• 1.1.2 PRRSV的形態(tài)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)11-12
• 1.1.3 PRRSV的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白12-14
• 1.1.4 PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白14-15
• 1.1.5 PRRSV的基因分型15
• 1.2 PRRSV的流行病學(xué)特征15-17
• 1.2.1 PRRSV的宿主及臨床癥狀15-16
• 1.2.2 PRRSV的病理變化16
• 1.2.3 PRRSV的傳播途徑16
• 1.2.4 PRRSV的疫苗與防控措施16-17
• 1.3 PRRSV的遺傳變異17-18
• 1.3.1 RNA病毒的復(fù)制特性17
• 1.3.2 準(zhǔn)種現(xiàn)象17-18
• 1.3.3 基因重組18
• 1.4 本研究的目的與意義18-20
• 2 材料與方法20-34
• 2.1 病毒、菌株、載體及細(xì)胞20
• 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑20
• 2.3 工具酶、試劑盒及主要的分子生物學(xué)試劑20-21
• 2.4 檢測樣品21
• 2.5 儀器設(shè)備21
• 2.6 PRRSV血清抗體的檢測21-22
• 2.7 引物的設(shè)計與合成22-23
• 2.8 樣品的RT-PCR檢測23-27
• 2.8.1 總RNA的提取23-24
• 2.8.2 cDNA的合成24
• 2.8.3 PCR擴增24-25
• 2.8.4 PCR回收產(chǎn)物與載體連接25
• 2.8.5 感受態(tài)細(xì)胞的制備25
• 2.8.6 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞25
• 2.8.7 PCR鑒定陽性菌液25
• 2.8.8 ORF5及部分Nsp2基因測序結(jié)果分析25-27
• 2.9 病毒的分離與鑒定27-29
• 2.9.1 病毒的分離27
• 2.9.2 分離病毒的PCR鑒定27
• 2.9.3 分離病毒的間接免疫熒光鑒定27-28
• 2.9.4 分離病毒的全基因組測序28
• 2.9.5 分離病毒的全基因組序列分析28-29
• 2.10 PRRSV Nsp1α及Nsp1β的原核表達(dá)29-34
• 2.10.1 Nsp1α及Nsp1β的擴增29
• 2.10.2 PCR擴增產(chǎn)物的純化29
• 2.10.3 目的片段與載體的雙酶切29-30
• 2.10.4 目的片段與載體的連接30
• 2.10.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備30
• 2.10.6 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化30
• 2.10.7 重組質(zhì)粒的抽提30-31
• 2.10.8 重組質(zhì)粒的酶切鑒定31
• 2.10.9 重組質(zhì)粒序列的測定31
• 2.10.10 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞31
• 2.10.11 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析31
• 2.10.12 重組蛋白SDS-PAGE鑒定31-32
• 2.10.13 重組蛋白最佳誘導(dǎo)時間的確定32
• 2.10.14 重組蛋白最佳IPTG誘導(dǎo)濃度的確定32
• 2.10.15 重組蛋白Western-Blot鑒定32-34
• 3 結(jié)果34-53
• 3.1 2014-2015年華南部分地區(qū)PRRSV抗體檢測結(jié)果34
• 3.2 2014-2015年華南部分地區(qū)PRRSV抗原檢測結(jié)果34-35
• 3.3 2014-2015年部分Nsp2基因氨基酸比對分析35-36
• 3.4 2014-2015年GP5基因遺傳進(jìn)化分析36-38
• 3.5 2014-2015年GP5基因氨基酸同源性分析38
• 3.6 2014-2015年GP5基因氨基酸突變位點分析38-41
• 3.7 歐洲型PRRSV GP5遺傳進(jìn)化及突變分析41-42
• 3.8 病毒的分離鑒定42
• 3.9 PRRSV全基因組的擴增42-43
• 3.10 PRRSV全基因組的遺傳進(jìn)化分析43-45
• 3.11 分離毒株全基因組的同源性分析45-47
• 3.12 分離毒株Nsp2及GP3/GP5/GP6基因氨基酸突變位點分析47-48
• 3.13 分離毒株Nsp9/Nsp10基因氨基酸突變位點分析48
• 3.14 Nsp1α及Nsp1β的擴增48-49
• 3.15 重組質(zhì)粒的酶切鑒定49
• 3.16 重組質(zhì)粒的表達(dá)與可溶性分析49-50
• 3.17 重組蛋白的最佳誘導(dǎo)時間的確定50-51
• 3.18 重組蛋白的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度的確定51-52
• 3.19 重組蛋白Western-blot鑒定52-53
• 4 討論53-56
• 4.1 2014-2015年華南部分地區(qū)PRRSV抗體和抗原的檢測53
• 4.2 Nsp2和GP5基因遺傳進(jìn)化與變異分析53-54
• 4.3 PRRSV的分離鑒定及全基因組序列分析54-55
• 4.4 PRRSV Nsp1α和Nsp1β的原核表達(dá)55-56
• 5 全文總結(jié)56-57
• 致謝57-58
• 參考文獻(xiàn)58-70

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 李冰;劉麗穎;王輝暖;周鐵忠;;歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染仔豬病理學(xué)特征及其組織內(nèi)病毒分布[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2015年07期

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本文編號：532513