本文關鍵詞：氣腫疽梭菌Dot-ELISA方法的建立及初步應用

  更多相關文章： 氣腫疽梭菌 標淮陽性血清 Dot-ELISA 菌體抗原 分泌抗原

【摘要】：氣腫疽梭菌(Closridium chauvoei.)是一種產芽孢的梭狀桿菌,產生的芽孢可長期存活在土壤中,經消化道或粘膜侵入機體,引起惡性水腫和氣性壞疽等癥狀,具有傳染性,可以感染人。針對該病的診斷尚無標準的血清學檢測技術。因此,本研究旨在以制備的標準陽性血清為抗體建立一種快速、簡便而且靈敏的血清學診斷方法,為日后氣腫疽診斷制劑的研制奠定理論與實踐基礎。本試驗成功的純化了由氣腫疽梭菌標準株C54-1的提取的有效抗原,以特異性最強的純化抗原免疫豚鼠,經四次免疫后獲得的血清以1 000倍稀釋后,用ELISA檢測其ODl150nm值達1.6以上,并經Dot-ELISA方法重復性試驗研究表明,該血清特異性和穩(wěn)定性優(yōu)良,可作為氣腫疽梭菌雙抗體夾心Dot-ELISA方法的一抗用于檢測。篩選最適反應條件是Dot-ELISA驗的重點。通過反復優(yōu)化,確定抗體最佳稀釋度為1：1024；可檢測到最低菌體抗原量為3.125μ g,最低分泌抗原量為1.89 μg；最適酶標二抗?jié)舛葹?：4 000。采用雙抗體夾心Dot-ELISA方法、AGID法和PCR法同時檢測30只致病豚鼠肝臟和脾臟碾磨液,結果Dot-ELISA方法與PCR法陽性符合率為93.3%,陽性檢出率是AGID法的2.5倍,表明該方法靈敏度很高。用試驗建立的雙抗體夾心Dot-ELISA檢測實驗室已確診病料,30份陽性樣本中檢出26份陽性結果,遠遠高于AGID法的檢出率,證明該方法準確性較高。本試驗是國內首次應用標準株氣腫疽梭菌純化抗原免疫SPF豚鼠制備的標準血清為一抗包被載體膜,建立了快速檢測氣腫疽病原體毒素的雙抗體夾心Dot-0ELISA診斷方法,該方法較ELISA法有更高的特異性和敏感性,可以檢測到微量氣腫疽梭菌毒素,且抗體用量少、易于保存、不需要特殊儀器、操作方便快捷,有望生產為試劑盒應用于臨床實踐對氣腫疽的快速檢測。
【關鍵詞】：氣腫疽梭菌 標淮陽性血清 Dot-ELISA 菌體抗原 分泌抗原
【學位授予單位】：延邊大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-10
• 前言10-16
• 1 病原體簡介10-11
• 1.1 菌體特征10
• 1.2 培養(yǎng)特征10-11
• 1.3 毒素特征11
• 2 流行病學及臨床癥狀特征11-12
• 3 實驗室診斷方法12-13
• 3.1 傳統(tǒng)的診斷方法12
• 3.2 血清學診斷方法12-13
• 3.3 分子生物學診斷13
• 4 氣腫疽的危害13-14
• 5 防治措施14
• 6 Dot-ELISA簡介14-15
• 7 本試驗研究的目的及意義15-16
• 材料與方法16-28
• 1 材料16-21
• 1.1 制備抗原用試劑16
• 1.2 SDS-PAGE和Western blotting16-19
• 1.3 Dot-ELISA用材料19
• 1.4 間接ELISA用材料19-20
• 1.5 PCR和AGID20
• 1.6 試驗動物20
• 1.7 試驗儀器20-21
• 2 方法21-28
• 2.1 肝片肉湯培養(yǎng)基21
• 2.2 血液瓊脂培養(yǎng)基21-22
• 2.3 氣腫疽梭菌培養(yǎng)22
• 2.4 生長曲線的測定22
• 2.5 抗原的初步提取22
• 2.6 氣腫疽梭菌抗原的純化22
• 2.7 純化抗原反應原性分析22-23
• 2.8 豚鼠的免疫程序23
• 2.9 動物模型的建立及被檢抗原的提取23
• 2.10 雙抗體夾心Dot-ELISA方法的建立23-24
• 2.11 最佳工作條件的篩選24-26
• 2.12 特異性試驗26
• 2.13 重復性試驗26
• 2.14 敏感性實驗26
• 2.15 比較試驗26-27
• 2.16 快診膜對已知病牛樣本的檢測27
• 2.17 快速診斷膜的保存期試驗27-28
• 結果28-43
• 1 氣腫疽梭菌培養(yǎng)結果28-29
• 2 生長曲線的測定29
• 3 初提抗原的制備及被檢抗原含量測定29
• 4 氣腫疽梭菌純化抗原的洗脫曲線29-30
• 5 純化抗原SDS-PAGE分析30-31
• 6 純化抗原Western blot分析31-32
• 7 氣腫疽梭菌標準血清制備結果32-33
• 7.1 豚鼠免疫程序32
• 7.2 間接ELISA方法條件的優(yōu)化32-33
• 8 Dot-ELISA的判定標準33-34
• 9 Dot-ELISA程序的優(yōu)化34-38
• 9.1 血清最適稀釋倍數(shù)的確定34
• 9.2 被檢抗原最適濃度的確定34-35
• 9.3 酶標二抗最適稀釋倍數(shù)的確定35-36
• 9.4 最適封閉液及封閉時間的確定36
• 9.5 底物最適顯色溫度及時間的確定36
• 9.6 最適包被液的確定36-37
• 9.7 最適樣品稀釋液的確定37
• 9.8 洗滌液及洗滌次數(shù)的確定37
• 9.9 最適反應溫度的確定37
• 9.10 最適反應時間的確定37
• 9.11 快診膜的選擇37-38
• 10 特異性試驗38-40
• 10.1 交叉反應試驗38-39
• 10.2 阻斷試驗39-40
• 11 重復性試驗40
• 12 敏感性試驗40-41
• 13 比較試驗41
• 14 快診膜對已知病牛樣本的檢測41-42
• 15 診斷膜的保存期試驗42-43
• 討論43-45
• 結論45-46
• 參考文獻46-50
• 致謝50-51
• 作者簡介51

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前2條

1 李香春;金鑫;樸春宇;金成德;樸春實;;利用SOE-PCR與TD-PCR技術對氣腫疽梭菌FliA(C)-NanA融合基因擴增方法的構建[J];安徽農業(yè)科學;2013年24期

2 ;[J];;年期

中國重要報紙全文數(shù)據庫 前1條

1 保健時報記者 魏鑫;割裂傷應及時正規(guī)清創(chuàng)[N];保健時報;2007年

中國碩士學位論文全文數(shù)據庫 前6條

1 司唯;氣腫疽梭菌PCR檢測方法的建立及初步應用[D];延邊大學;2015年

2 姜永越;氣腫疽梭菌Dot-ELISA方法的建立及初步應用[D];延邊大學;2016年

3 車達;氣腫疽梭菌單克隆抗體的制備及鑒定[D];延邊大學;2011年

4 陳瑩瑩;氣腫疽梭菌抗原提純及分析[D];延邊大學;2012年

5 姜丹丹;氣腫疽梭菌單克隆抗體的制備及膠體金診斷試紙條的研制[D];延邊大學;2013年

6 云巾宴;延邊株氣腫疽梭菌的分離鑒定及cctA基因的克隆和表達[D];延邊大學;2015年

，

本文編號：524856