發(fā)布時(shí)間：2017-07-06 05:12

  本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用LCM技術(shù)結(jié)合冰凍切片捕獲奶牛生精細(xì)胞及RNA的提取

  更多相關(guān)文章： 生精細(xì)胞 冰凍切片 激光顯微切割 附睪尾精子 RNA

【摘要】：精原細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂后生成圓形精子細(xì)胞,再經(jīng)變態(tài)發(fā)育,最終成為成熟精子,在變態(tài)發(fā)育過(guò)程中,染色質(zhì)高度固縮,轉(zhuǎn)錄活性逐漸降低,并伴隨細(xì)胞質(zhì)的大量丟失,導(dǎo)致精子細(xì)胞內(nèi)RNA含量極少。目前,精子內(nèi)種類繁多的RNA成分雖已被檢測(cè)證實(shí),但精子是否存在轉(zhuǎn)錄活性仍存在較大爭(zhēng)議,因此,研究精子變態(tài)前后轉(zhuǎn)錄表達(dá)趨勢(shì)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)模式動(dòng)物小鼠精子發(fā)育過(guò)程的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行了研究,通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)在圓形、長(zhǎng)形精子細(xì)胞和成熟精子間存在大量差異表達(dá)基因,且通過(guò)熒光定量PCR驗(yàn)證了結(jié)果的可靠性。對(duì)于荷斯坦牛精子發(fā)育過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是否和嚙齒動(dòng)物有相同的變化趨勢(shì),其與體細(xì)胞的差異性仍需進(jìn)行深入研究。本實(shí)驗(yàn)采集了荷斯坦牛睪丸及附睪組織,在前期小鼠實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,通過(guò)延長(zhǎng)組織塊平衡和切片染色時(shí)間及加大激光能量及頻率等條件優(yōu)化,建立了合適的荷斯坦牛睪丸組織冰凍切片制作、染色及激光顯微切割捕獲體系。通過(guò)優(yōu)化后的體系共捕獲了90 576個(gè)圓形精子細(xì)胞、122 651個(gè)長(zhǎng)形精子細(xì)胞及67 818個(gè)精原干細(xì)胞樣品(每樣品各三個(gè)生物學(xué)重復(fù)),并通過(guò)精子浮游法獲得107個(gè)附睪尾精子,為后續(xù)研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。由于精子難以裂解、RNA含量低,且制備難度大,本研究比較了兩種試劑盒及Trizol法三種RNA制備方法的制備效果,發(fā)現(xiàn)RNeasy Kit的RNA制備效率高且效果穩(wěn)定(單個(gè)精子RNA含量為0.023~0.025 pg),可以用于后續(xù)高通量測(cè)序RNA樣品的制備。并采用PicoPureTMRNA Isolation Kit進(jìn)行了圓形、長(zhǎng)形精子細(xì)胞及精原干細(xì)胞的RNA制備。在進(jìn)行精子RNA制備時(shí),采用的體細(xì)胞裂解液進(jìn)行了白細(xì)胞、上皮細(xì)胞等體細(xì)胞的去除,并利用白細(xì)胞和上皮細(xì)胞的特異表達(dá)基因CD45和CDH1及持家基因GAPDH(跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)檢測(cè)體細(xì)胞及基因組污染,以確保后續(xù)高通量測(cè)序的RNA樣品質(zhì)量。另外,本研究通過(guò)大量細(xì)胞樣本,測(cè)算了單個(gè)生精細(xì)胞RNA含量,單因子方差分析結(jié)果顯示,圓形精子細(xì)胞、長(zhǎng)形精子細(xì)胞、附睪尾精子及精原干細(xì)胞RNA含量有顯著差異,不但二倍體細(xì)胞(精原干細(xì)胞)和生殖細(xì)胞間存在顯著差異(P0.05),隨著精子細(xì)胞的變態(tài)發(fā)育,其RNA含量逐漸減少,精子細(xì)胞圓形和長(zhǎng)形精子細(xì)胞中RNA含量分別為附睪尾精子的752和413倍。采用Smart-seq2方法對(duì)各級(jí)生精細(xì)胞cDNA進(jìn)行微量擴(kuò)增,并檢測(cè)其cDNA量及完整性,各樣品cDNA含量均高于20 ug,且在1~2 kb間均有目的產(chǎn)物,完整性較好,符合建庫(kù)要求。本研究根據(jù)牛睪丸組織特點(diǎn)建立了的冰凍切片方法和細(xì)胞取樣技術(shù)體系,并獲得了大量圓形、長(zhǎng)形精子細(xì)胞和精原干細(xì)胞樣品;同時(shí)得到了高效的精子RNA制備方法,并獲得了變態(tài)期間的單細(xì)胞RNA含量及變化趨勢(shì);另外通過(guò)微量cDNA擴(kuò)增獲得了足夠量且完整的cDNA,為精子RNA高通量測(cè)序奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為精子發(fā)生與變形機(jī)理研究提供了重要參考。
【關(guān)鍵詞】：生精細(xì)胞 冰凍切片 激光顯微切割 附睪尾精子 RNA
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-18
• 1.1 精子變形期間轉(zhuǎn)錄本存在巨大差異12
• 1.2 活力不同精子間轉(zhuǎn)錄本差異較大12-13
• 1.3 獲能前后精子轉(zhuǎn)錄本發(fā)生了較大差異13-14
• 1.4 精子冷凍前后轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生較大差異14
• 1.5 冰凍切片技術(shù)14-15
• 1.6 激光顯微切割技術(shù)15-16
• 1.7 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)16-17
• 1.8 展望17
• 1.9 本研究的目的、意義與研究?jī)?nèi)容17-18
• 第二章 試驗(yàn)材料與方法18-30
• 2.1 試驗(yàn)材料18-20
• 2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物18
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備與試劑耗材18-19
• 2.1.2.1 主要試驗(yàn)儀器設(shè)備及廠商18
• 2.1.2.2 主要試劑及購(gòu)買公司18-19
• 2.1.2.3 試驗(yàn)耗材19
• 2.1.3 主要試驗(yàn)試劑的配制19-20
• 2.2 技術(shù)路線20-21
• 2.3 試驗(yàn)方法21-30
• 2.3.1 樣品的采集21-23
• 2.3.1.1 睪丸及附睪的采集21
• 2.3.1.2 附睪尾精子的采集及活力檢測(cè)21-22
• 2.3.1.3 圓形、長(zhǎng)形精子細(xì)胞及精原干細(xì)胞的獲取22-23
• 2.3.2 總RNA制備23-25
• 2.3.2.1 精子總RNA制備23-25
• 2.3.2.2 圓形、長(zhǎng)形精子細(xì)胞及精原干細(xì)胞RNA提25
• 2.3.2.3 睪丸組織RNA提取25
• 2.3.3 總RNA質(zhì)量評(píng)估25-28
• 2.3.3.1 總RNA濃度、OD值得測(cè)定25
• 2.3.3.2 總RNA基因組、體細(xì)胞去除效果檢測(cè)25-28
• 2.3.4 統(tǒng)計(jì)分析28
• 2.3.5 cDNA擴(kuò)增及質(zhì)量檢測(cè)28-30
• 2.3.5.1 反轉(zhuǎn)錄28
• 2.3.5.2 PCR預(yù)擴(kuò)增28-29
• 2.3.5.3 cDNA質(zhì)量檢測(cè)29-30
• 第三章 試驗(yàn)結(jié)果與分析30-43
• 3.1 樣品的采集30-33
• 3.1.1 附睪尾精子采集及活力檢測(cè)30
• 3.1.2 圓形、長(zhǎng)形精子細(xì)胞及精原干細(xì)胞的獲取30-33
• 3.2 RNA質(zhì)量檢測(cè)33-37
• 3.2.1 三種方法提取的精子RNA質(zhì)量檢測(cè)33-34
• 3.2.1.1 精子RNA濃度及OD值檢測(cè)33
• 3.2.1.2 凝膠電泳檢測(cè)33-34
• 3.2.2 各樣品總RNA制備效果檢測(cè)34-37
• 3.2.2.1 各樣品總RNA濃度及OD值檢測(cè)34
• 3.2.2.2 單個(gè)生精細(xì)胞RNA含量34-35
• 3.2.2.3 總RNA凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果35
• 3.2.2.4 基因組DNA去除效果檢測(cè)35-36
• 3.2.2.5 體細(xì)胞去除效果檢測(cè)36-37
• 3.3 生精細(xì)胞的RNA含量37
• 3.4 CDNA擴(kuò)增質(zhì)量檢測(cè)37-43
• 3.4.1 cDNA濃度檢測(cè)37-38
• 3.4.2 cDNA完整性檢測(cè)38-43
• 第四章 討論與結(jié)論43-47
• 4.1 討論43-46
• 4.1.1 關(guān)于冰凍切片制作43-44
• 4.1.2 關(guān)于切片染色44
• 4.1.3 關(guān)于激光顯微切割技術(shù)44
• 4.1.4 關(guān)于精子RNA提取方法44-45
• 4.1.5 關(guān)于生精細(xì)胞總RNA凝膠電泳檢測(cè)45
• 4.1.6 關(guān)于基因組和體細(xì)胞污染檢測(cè)45
• 4.1.7 關(guān)于生精細(xì)胞RNA含量分析45-46
• 4.1.8 關(guān)于cDNA擴(kuò)增46
• 4.2 全文結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 致謝53-54
• 作者簡(jiǎn)歷54

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