本文關(guān)鍵詞：豬cGAS基因的克隆與原核表達(dá)

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【摘要】：【目的】環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,c GAS)是近期在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種新型核酸轉(zhuǎn)移酶,能夠識(shí)別胞質(zhì)DNA,催化ATP和GTP生成第二信使c GAMP,繼而通過(guò)STING依賴(lài)的方式活化轉(zhuǎn)錄因子IRF3,啟動(dòng)機(jī)體固有免疫。通過(guò)構(gòu)建含豬c GAS基因的重組質(zhì)粒p Bb B3a-His6-Nus A-c GAS,進(jìn)行原核表達(dá),得到c GAS蛋白,為進(jìn)行體外催化合成c GAMP及探討其在天然免疫過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)�！痉椒ā恳载i脾臟c DNA為模板克隆豬c GAS的蛋白編碼區(qū)(open reading frame,ORF),用非酶連接技術(shù)將此基因克隆至丙酸誘導(dǎo)型原核表達(dá)載體p Bb B3a-His6-Nus A-LIC中。菌液PCR進(jìn)行陽(yáng)性克隆鑒定并測(cè)序。將測(cè)序鑒定正確的克隆菌液提取質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中。當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí),丙酸鈉誘導(dǎo)表達(dá)His6-Nus A-c GAS融合蛋白,用20 mmol·L~(-1)丙酸鈉在20℃,180 r/min分別誘導(dǎo)0、2、4、6、8、10 h,以確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間;然后,分別用0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 mmol·L~(-1)的丙酸鈉在20℃,180 r/min誘導(dǎo)6 h,以確定最佳誘導(dǎo)丙酸鈉誘導(dǎo)濃度;另外,分別在20℃,30℃,37℃條件下用20 mmol·L~(-1)丙酸鈉,180 r/min培養(yǎng)6 h,以確定最佳誘導(dǎo)溫度。篩選最佳誘導(dǎo)條件,并用SDS-PAGE和Western blotting進(jìn)行鑒定�！窘Y(jié)果】(1)本試驗(yàn)成功克隆了豬c GAS基因,其ORF長(zhǎng)度為1 494 bp;(2)構(gòu)建了c GAS丙酸誘導(dǎo)型原核表達(dá)載體p Bb B3a-His6-Nus A-c GAS;(3)His6-Nus A-c GAS融合蛋白在37℃,添加20 mmol·L~(-1)丙酸鈉,誘導(dǎo)6 h時(shí)表達(dá)量最高。(4)His6-Nus A-c GAS融合蛋白在裂解菌液的上清和沉淀中均有表達(dá),相對(duì)分子質(zhì)量為111.87 k D�！窘Y(jié)論】運(yùn)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了c GAS融合蛋白,本試驗(yàn)為體外表達(dá)c GAS融合蛋白提供技術(shù)方法。
【作者單位】： 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室;
【關(guān)鍵詞】： 豬cGAS 非酶連接 丙酸誘導(dǎo) 原核表達(dá)
【基金】：農(nóng)業(yè)部“948”重點(diǎn)計(jì)劃(2011-G35) 河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)(112102310705)
【分類(lèi)號(hào)】：S852.2
【正文快照】： 0引言【研究意義】進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)的DNA被機(jī)體固有免疫系統(tǒng)認(rèn)為是一種潛在的病原信號(hào),當(dāng)機(jī)體感知到胞質(zhì)中的DNA時(shí),可觸發(fā)固有免疫反應(yīng),產(chǎn)生I型干擾素和其他細(xì)胞因子[1-5]。但一直以來(lái),對(duì)于固有免疫系統(tǒng)如何感知胞質(zhì)DNA的機(jī)制尚不明確。環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-腺苷酸合成酶(cyclic gua

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中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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3 林海波;張桂紅;詹國(guó)英;廖明;任濤;羅開(kāi)健;曹偉勝;徐成剛;辛朝安;;豬白細(xì)胞介素-6基因的非融合原核表達(dá)研究[A];第一屆中國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)和疾病控制技術(shù)大會(huì)——2005中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2005年

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10 馬文濤;閆若潛;吳志明;劉光輝;盛敏;謝彩華;;豬白細(xì)胞介素-6的原核表達(dá)及其生物學(xué)活性研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第四次豬病防控學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

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3 黃新河;小鼠TAp63γ的原核表達(dá)、純化、結(jié)構(gòu)及功能初步研究[D];四川大學(xué);2007年

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5 張少斌;豌豆肌動(dòng)蛋白異型體（PEAc1）的原核表達(dá)及其藻熒光探針的研制[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

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7 韓凌霞;豬圓環(huán)病毒2型基因的原核表達(dá)與單克隆抗體的制備及感染性分子克隆的動(dòng)物接種試驗(yàn)[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2003年

8 于揚(yáng);重組人源GPx4及其模擬物的原核表達(dá)、結(jié)構(gòu)與功能的研究[D];吉林大學(xué);2013年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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