本文關(guān)鍵詞：水貂呼腸孤病毒分離鑒定及反向遺傳初步研究

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【摘要】：20世紀(jì)50年代呼腸孤病毒的發(fā)現(xiàn),首次證實(shí)了雙鏈RNA病毒可作為穩(wěn)定的生命形式存在于自然界,由于主要從呼吸道或腸道中分離出此病毒,并且當(dāng)時(shí)對(duì)它的致病作用不清楚,所以稱它為呼吸道、腸道、孤兒病毒,簡稱呼腸孤病毒(Reovirus)。哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒(Mammalian Orthoreovirus,MRV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridea)正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)成員,病毒粒子無囊膜,二十面體對(duì)稱,具有雙層衣殼�；蚪M由10條雙鏈RNA組成,分為3個(gè)大片段(L1~L3)、3個(gè)中片段(M1~M3)以及4個(gè)小片段(S1~S4),共編碼8種結(jié)構(gòu)蛋白和3種非結(jié)構(gòu)蛋白。MRV有4個(gè)主要的血清型,其代表株為血清1型Lang(T1L)、血清2型Jones(T2J)、血清3型Dearing(T3D)以及血清4型Ndelle(T4N)。目前有關(guān)水貂呼腸孤病毒的報(bào)道較少,1975年德國研究人員首次從水貂中分離到一株呼腸孤病毒,1992年劉維全等在國內(nèi)首次報(bào)道了一株從水貂中分離的呼腸孤病毒,2011年連海等首次從水貂中分離到一株血清1型呼腸孤病毒HB-A株。雖然大多數(shù)呼腸孤病毒感染并沒有明顯癥狀或癥狀較輕,但是該病毒可能與其他病毒混合感染從而加重病情,造成水貂生長遲緩、被毛粗亂,嚴(yán)重影響貂皮的質(zhì)量,從而給養(yǎng)殖業(yè)造成損失。反向遺傳學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域,極大推動(dòng)了病毒學(xué)發(fā)展。與經(jīng)典的從表型改變到進(jìn)行基因功能研究的思路相反,反向遺傳技術(shù)是指通過構(gòu)建RNA病毒的感染性克隆,在病毒cDNA分子水平上對(duì)其進(jìn)行人工體外操作,如進(jìn)行基因突變、缺失、插入、置換等改造,從而研究RNA病毒的基因復(fù)制與表達(dá)調(diào)控機(jī)制、病毒和宿主細(xì)胞的相互作用關(guān)系、抗病毒策略和基因治療,以及構(gòu)建新型病毒載體來表達(dá)外源基因和進(jìn)行新疫苗研制等,因此對(duì)RNA病毒進(jìn)行遺傳拯救已成為分子病毒學(xué)研究的必經(jīng)之路。然而,呼腸孤病毒基因組的復(fù)雜性妨礙了其反向遺傳系統(tǒng)的建立,也制約了病毒各方面的研究。2014年山東某貂廠發(fā)生以腹瀉癥狀為主的疾病,取腸道內(nèi)容物接種于BHK-21和Vero細(xì)胞,經(jīng)盲傳,細(xì)胞出現(xiàn)了變圓、脫落等病變。經(jīng)電鏡觀察,觀察到無囊膜、二十面體對(duì)稱、雙層衣殼和直徑約75 nm的病毒粒子。RT-PCR和BLAST結(jié)果表明,病毒粒子為哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒,命名為MRV3 SD-14株。測定了SD-14株的病毒滴度、血凝性以及致病性,SD-14株在BHK-21和Vero細(xì)胞上的tcid50為105.625tcid50/ml和105tcid50/ml;sd-14株在4℃、室溫以及37℃條件下,對(duì)人o型血紅細(xì)胞以及雞、豚鼠、牛和兔的紅細(xì)胞均不發(fā)生凝集反應(yīng);將sd-14株經(jīng)口和腦內(nèi)接種乳鼠,對(duì)乳鼠不致病,對(duì)其生長沒有明顯影響。設(shè)計(jì)特異引物,經(jīng)rt-pcr獲得了sd-14株全基因組序列,并將序列提交到genbank數(shù)據(jù)庫中,登錄號(hào)為kt224504-kt224513。序列分析結(jié)果表明,sd-14株為血清3型呼腸孤病毒,其l1、l3、m3和s3與人源mrv2tou05株有較高相似度,分別為97.40%,96.92%,97.09%和97.20%;s2與t1l標(biāo)準(zhǔn)株有較高相似度,為96.17%;l2、m2及s1與豬源的gd-1株有較高相似度,分別為97.39%、98.37%和98.66%;m1和s4與豬源的sc-a株有較高相似度,分別為95.53%和97.58%。此外,sd-14株與貂源的hb-a株具有高度的序列相似性。綜合序列的相似性以及根據(jù)每個(gè)片段所構(gòu)建的進(jìn)化樹,推測sd-14株為人源、豬源以及貂源呼腸孤病毒混合感染產(chǎn)生的新的重組病毒。此外,序列分析顯示,sd-14株的s1片段第246個(gè)密碼子為終止密碼子,可能造成σ1蛋白翻譯提前終止,從而對(duì)病毒的生物學(xué)特性產(chǎn)生影響。sd-14株是首次從水貂中分離獲得的血清3型呼腸孤病毒,sd-14株的分離豐富了水貂呼腸孤病毒的基因庫以及生物特性,對(duì)于研究呼腸孤病毒在水貂群中的流行、進(jìn)化等具有重要意義。為了解呼腸孤病毒在水貂群中的感染情況,本實(shí)驗(yàn)采用微量中和試驗(yàn)調(diào)查了山東、河北以及吉林水貂群中呼腸孤病毒的血清抗體水平,以期從抗體水平了解呼腸孤病毒感染的流行狀況。結(jié)果表明,血清陽性率分別為:山東92.5%,河北82.1%,吉林91.7%,表明該病毒在上述地區(qū)水貂群中具有較高水平的感染率。建立呼腸孤病毒反向遺傳操作平臺(tái),是深入研究該病毒的蛋白功能以及致病機(jī)制的關(guān)鍵途徑。本研究首先對(duì)呼腸孤病毒hb-a株進(jìn)行了全基因組測序,以確定病毒真實(shí)的cdna序列,為下一步構(gòu)建全長cdna克隆提供參考。通過rt-pcr獲得呼腸孤病毒hb-a株全基因組10個(gè)片段,將其分別插入含t7rna聚合酶啟動(dòng)子、丁肝病毒核酶以及t7rna聚合酶終止子的表達(dá)盒中,獲得10個(gè)重組質(zhì)粒pcdna-t7-l1、pcdna-t7-l2、pcdna-t7-l3、pcdna-t7-m1、pcdna-t7-m2、pcdna-t7-m3、pcdna-t7-s1、pcdna-t7-s2、pcdna-t7-s3和pcdna-t7-s4,同時(shí)將l1片段2193位的t突變?yōu)閏,作為分子標(biāo)記,以區(qū)分野毒和重組毒。此外,將σ1s蛋白的起始密碼子由atg突變?yōu)閍cg,使σ1s蛋白不表達(dá),為構(gòu)建σ1s蛋白缺失突變型呼腸孤病毒做準(zhǔn)備。將10個(gè)重組質(zhì)粒按照合適的配比濃度共轉(zhuǎn)染bhk-t7細(xì)胞系,37℃培養(yǎng)3~5d,收獲細(xì)胞并反復(fù)凍融3次,在bhk-21細(xì)胞上進(jìn)行傳代。本研究首次分離到一株貂源血清3型呼腸孤病毒mrv3sd-14株,并對(duì)其增殖、感染和血凝等生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定;對(duì)山東、河北、吉林等地水貂群的呼腸孤病毒感染率進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查,證實(shí)該病毒感染在上述地區(qū)水貂群中普遍存在;進(jìn)行了呼腸孤病毒HB-A株反向遺傳初步研究,為呼腸孤病毒感染、重組和致病機(jī)制研究奠定了一定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：呼腸孤病毒 水貂 病毒分離 血清學(xué)調(diào)查 反向遺傳學(xué)
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 英文縮寫詞表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-15
• 第一章 呼腸孤病毒MRV3 SD-14株的分離鑒定15-45
• 1 材料與方法15-25
• 1.1 材料15-17
• 1.2 方法17-25
• 2 結(jié)果25-39
• 2.1 病毒的CPE特征25-26
• 2.2 病毒電鏡觀察結(jié)果26-27
• 2.3 病毒RT-PCR鑒定結(jié)果27
• 2.4 病毒滴度27
• 2.5 病毒血凝性27-28
• 2.6 病毒致病性28
• 2.7 病毒全基因組分析28-39
• 3 討論39-40
• 4 小結(jié)40-42
• 參考文獻(xiàn)42-45
• 第二章 我國部分地區(qū)水貂群中呼腸孤病毒中和抗體調(diào)查45-51
• 1 材料與方法45-47
• 1.1 材料45-46
• 1.2 方法46-47
• 2 結(jié)果47-48
• 2.1 血清陽性率47-48
• 3 討論48
• 4 小結(jié)48-50
• 參考文獻(xiàn)50-51
• 第三章 呼腸孤病毒HB-A株全基因組cDNA克隆的構(gòu)建51-69
• 1 材料與方法51-61
• 1.1 材料51-53
• 1.2 方法53-61
• 2 結(jié)果61-64
• 2.1 全基因組cDNA的獲得61-62
• 2.2 克隆載體的鑒定62
• 2.3 全基因組cDNA克隆的鑒定62-63
• 2.4 L1遺傳標(biāo)記的鑒定63-64
• 2.5 S1突變位點(diǎn)的鑒定64
• 3 討論64-66
• 4 小結(jié)66-67
• 參考文獻(xiàn)67-69
• 個(gè)人簡歷69-70
• 致謝70

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1 Louis Vander Heide ,劉文波;呼腸孤病毒簡介[J];國外畜牧科技;2002年01期

2 方勤,丁清泉,汪亞平,朱作言;兩株水生呼腸孤病毒部分特性的比較[J];中國病毒學(xué);2003年05期

3 方勤,丁清泉;呼腸孤病毒內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[J];中國病毒學(xué);2004年05期

4 曾智勇;郭萬柱;徐志文;宋振輝;殷華平;王新;王小玉;;仔豬腹瀉糞樣中豬呼腸孤病毒的分離鑒定[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2007年06期

5 何小明;姚火春;張洪彪;藺濤;袁世山;龍進(jìn)學(xué);丁鏟;;一株豬源1型呼腸孤病毒的分離及鑒定[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2013年01期

6 陳仕龍;陳少鶯;林鋒強(qiáng);王劭;程曉霞;朱小麗;李兆龍;王錦祥;;兩株不同疾病型鴨呼腸孤病毒部分生物學(xué)特性的比較[J];福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2013年01期

7 方勤,朱作言;呼腸孤病毒結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報(bào);2003年04期

8 郝雪;張?jiān)?郭東春;孫斌;;禽(雞)呼腸孤病毒99G株σB編碼基因的克隆及其在大腸桿菌中的高效表達(dá)[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2007年06期

9 高巍;張建軍;莊新娟;吳小春;朱江寧;高磊;王永坤;;鵝呼腸孤病毒江蘇分離株的分離鑒定[J];中國家禽;2011年06期

10 王吉;衛(wèi)禮;岳秉飛;賀爭鳴;;呼腸孤病毒Ⅲ型免疫熒光檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2011年08期

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1 黃瑜;程龍飛;李文楊;施少華;;雛半番鴨呼腸孤病毒的分離與鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2002年

2 吳異健;劉文興;吳寶成;;禽類呼腸孤病毒(Avian reoviruses)感染[A];福建省科協(xié)第四屆學(xué)術(shù)年會(huì)衛(wèi)星會(huì)議“動(dòng)物疫病防治與人類健康”學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2004年

3 何小明;姚火春;張洪彪;藺濤;袁世山;龍進(jìn)學(xué);丁鏟;;一株豬源1型呼腸孤病毒的分離及鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會(huì)第三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

4 楊興婁;譚兵;葛行義;石正麗;;中國食蟲蝙蝠中正呼腸孤病毒的分離鑒定及流行病學(xué)調(diào)查[A];2013年湖北省暨武漢微生物學(xué)會(huì)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2013年

5 凌勇;陳曦;楊君敬;蘇北;曾光旭;袁吉磊;何誠;;禽新呼腸孤病毒的分離與初步鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十四次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

6 陳中元;高小蟬;張奇亞;;鱸魚呼腸孤病毒的全基因組測序及其序列分析[A];2012年鄂粵微生物學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)——湖北省暨武漢微生物學(xué)會(huì)成立六十年慶祝大會(huì)論文集[C];2012年

7 張?jiān)?陳小丹;李永峰;劉明;童光志;;抗番鴨呼腸孤病毒σB蛋白單克隆的制備和鑒定(英文)[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會(huì)第二次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

8 劉文興;王劭;吳寶成;;禽類呼腸孤病毒的分子生物學(xué)[A];福建省科協(xié)第四屆學(xué)術(shù)年會(huì)衛(wèi)星會(huì)議“動(dòng)物疫病防治與人類健康”學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2004年

9 馬國明;王丹;施佳健;張大丙;;一株鴨呼腸孤病毒的基因組序列分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

10 陳仕龍;陳少鶯;程曉霞;林鋒強(qiáng);江斌;王劭;朱小麗;張世忠;李兆龍;;新型鴨呼腸孤病毒分離株的致病性研究[A];福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2009年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2009年

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1 鄭獻(xiàn)進(jìn);兩株北京鴨源呼腸孤病毒生物學(xué)特性比較[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 張曉戰(zhàn);哺乳動(dòng)物源呼腸孤病毒激活PI3K/Akt通路調(diào)控宿主抗病毒免疫應(yīng)答的分子機(jī)制[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

3 冉旭華;犬蝠源呼腸孤病毒的分離鑒定及其生物學(xué)特性的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2006年

4 曾智勇;豬呼腸孤病毒SC-A株的分離鑒定及全基因組cDNA文庫的構(gòu)建和分子遺傳特征分析[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

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1 崔亞婷;溫度對(duì)青蟹雙順反子病毒-1和呼腸孤病毒增殖的影響以及病毒的組織分布[D];上海海洋大學(xué);2015年

2 韓宏宇;新型鴨呼腸孤病毒檢測方法及細(xì)胞適應(yīng)性的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 畢莊莉;新型鴨呼腸孤病毒σC基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及其免疫原性的初步研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

4 劉水芳;一株鵝呼腸孤病毒的分離鑒定及全基因組序列分析[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

5 張永武;水貂呼腸孤病毒分離鑒定及反向遺傳初步研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2016年

6 張寶來;鴨源呼腸孤病毒的分離與鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

7 楊旭;鴨源呼腸孤病毒熒光定量RT-PCR方法的建立與應(yīng)用[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

8 梁英;禽（雞源）呼腸孤病毒的分離與鑒定[D];福建農(nóng)林大學(xué);2005年

9 朱英奇;新型鴨呼腸孤病毒的鑒定及其全基因組序列解析[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

10 何小明;豬源呼腸孤病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及分離株的鑒定[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

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