發(fā)布時間：2017-07-02 20:27

  本文關鍵詞：動物腸道源抗鉛益生乳酸菌的分離、鑒定及其緩解鉛毒性的機理研究

  更多相關文章： 乳酸菌 篩選 鉛 急性中毒 保護 腸粘膜屏障

【摘要】：鉛(Lead,Pb)作為地球上分布廣泛且含量豐富的重金屬之一,同時也是最嚴重的環(huán)境污染物。鉛屬于機體非必需元素,尚未證實其具有營養(yǎng)性,但對機體的積累性毒害作用被廣泛認同。鉛蓄積在體內,可造成神經系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和造血等方面功能障礙,引起腦、腎、肝和神經等損傷。近年來,許多國家,尤其發(fā)展中國家,鉛污染和鉛中毒已成為廣泛關注的公共健康問題。常規(guī)的螯合劑治療和新興起的營養(yǎng)干預治療方法,存在具有明顯副作用并且影響必需金屬元素等弊端,所以,尋找一些新的策略對鉛中毒,開發(fā)安全、有效、無毒副作用、綠色的新型解毒制劑或膳食補充劑將成為一種必然趨勢。在治理重金屬污染水源和土壤的領域,微生物吸附法因其操作簡易、清除效率高、來源豐富、成本低、副產物少等優(yōu)勢而得到青睞和應用,能否應用微生物清除或緩解人或動物重金屬毒性值得深入探討。作為公認的食品安全級微生物,已有報道顯示乳酸菌可以高效吸附重金屬鉛離子,緩解鉛的毒性作用,但作用機制尚未完全明確。所以,本課題旨在篩選多種動物腸道來源能夠在體外耐受重金屬鉛離子,并且具有優(yōu)良益生性質的乳酸菌;進一步通過建立動物模型驗證其在體內的功能,研究其緩解重金屬鉛中毒的作用機理,為開發(fā)利用乳酸菌作為重金屬清除劑添加到動物飼料或食品中奠定理論和物質基礎。以下為主要研究結果:首先,利用含Pb2+MRS固體培養(yǎng)基,從多種健康動物腸道分離乳酸菌,通過革蘭氏染色、形態(tài)觀察、觸酶試驗的初步篩選,共得到38株符合標準的菌株。這些菌株均具有很強的鉛耐受能力,最大耐受鉛離子濃度可達到2 000 mg/L;在600 mg/L鉛離子溶液中,對鉛吸附率均在60%以上,最高可到84%。進而,模擬體外胃腸道環(huán)境,進行耐受強酸、強堿、膽鹽和胰蛋白酶的測定,篩選出20株符合標準的菌株,其中的5株對常見的五種病原菌具有良好的抑制效果。隨之,對這5株具有優(yōu)良益生性質的菌株進行16S rRNA鑒定,確定菌株分別是羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、嗜淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。最后,測定對清除羥自由基、清除DPPH自由基以及還原能力,證實這5株乳酸菌具有一定的抗氧化能力。其中,羅伊氏乳桿菌21008菌株鉛耐受能力和吸附能力、益生性質、體外抗氧化能力表現(xiàn)最為突出,所以,選擇羅伊氏乳桿菌21008菌株進行后續(xù)試驗。之后,通過建立重金屬鉛急性中毒小鼠模型,評價口服羅伊氏乳桿菌21008對鉛中毒的緩解效果,并解析其緩解鉛毒性的機制。分別設立對照組、LAB-5d組(先灌喂5d乳酸菌,之后染毒)、MRS-5d組(先灌喂5d MRS,之后染毒)、LAB-12d組(先灌喂5d乳酸菌,之后染毒,并持續(xù)灌喂乳酸菌12d)和MRS-12d組(先灌喂5d MRS,之后染毒,并持續(xù)灌喂MRS 12d),檢測肝臟、腎臟和糞便中鉛的含量,組織病理學變化的觀察,氧化應激檢測,檢測相關mRNA表達水平和炎癥相關信號通路的蛋白表達水平,通過這些指標對灌喂羅伊氏乳桿菌21008緩解鉛毒性的機制進行探究。結果表明,灌喂羅伊氏乳桿菌21008能明顯緩解急性鉛中毒小鼠體重降低,減輕急性鉛毒性導致的機體病理損傷,保護小鼠腸道粘膜屏障。灌喂羅伊氏乳桿菌21008不但能夠降低肝臟和腎臟中鉛的含量,還能促進鉛隨糞便排出,從而抑制腸道對鉛的吸收,保護腸道免受鉛毒性引起的病理損傷。同時,羅伊氏乳桿菌21008可以緩解鉛中毒引起的氧化應激,促進有關檢測指標趨于健康對照組,降低鉛毒性導致的機體氧化損傷。另外,羅伊氏乳桿菌21008可以降低急性鉛中毒引發(fā)炎癥因子(如IL-6,IFN-γ和TNF-α等)轉錄水平,提高抗炎因子(如IL-10等)轉錄水平,并且提高腸道緊密連接因子的轉錄水平,表明羅伊氏乳桿菌21008在體內可以抑制鉛毒性引發(fā)的炎癥反應,并且維護腸道粘膜屏障。試驗還發(fā)現(xiàn),羅伊氏乳桿菌21008具有調節(jié)炎癥相關信號通路P38 MAPK和NF-κB的蛋白表達,促進機體對鉛的解毒作用。值得注意的是,LAB-12d組在肝腎中鉛含量高于MRS-12d組,推測與乳酸菌吸附鉛并定植于腸道造成重新吸收有關。本研究進一步驗證乳酸菌具有緩解鉛急性毒性作用,其保護機制與維護腸黏膜屏障功能、調節(jié)細胞因子表達、減緩氧化應激等有關,其保護性作用可能是通過調節(jié)P38 MAPK和NF-κB信號通路而實現(xiàn)的。羅伊氏乳桿菌21008有望作為綠色安全的生物制劑用于預防或治療鉛中毒,為下一步開發(fā)乳酸菌作為重金屬清除劑添加到動物飼料或食品中奠定基礎。
【關鍵詞】：乳酸菌 篩選 鉛 急性中毒 保護 腸粘膜屏障
【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S816
【目錄】：

• 摘要10-12
• 英文摘要12-15
• 1 前言15-21
• 1.1 重金屬鉛的概述15
• 1.2 重金屬鉛的危害15-16
• 1.2.1 對環(huán)境的影響15
• 1.2.2 對機體的危害15-16
• 1.3 治療鉛中毒的方法16-17
• 1.3.1 螯合劑療法16
• 1.3.2 營養(yǎng)干預或膳食療法16-17
• 1.3.3 現(xiàn)有療法的弊端17
• 1.4 微生物吸附重金屬的研究進展17-18
• 1.5 乳酸菌抗重金屬機制的研究進展18-19
• 1.5.1 乳酸菌對重金屬的吸附與去除18
• 1.5.2 乳酸菌緩解機體的氧化應激18
• 1.5.3 乳酸菌對機體腸道黏膜免疫的調節(jié)作用18-19
• 1.5.4 乳酸菌的益生作用19
• 1.6 研究目的和意義19-21
• 2 材料與方法21-31
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 試驗試劑與菌種21
• 2.1.2 試驗動物21
• 2.1.3 引物合成21-22
• 2.1.4 試驗儀器和設備22-23
• 2.2 耐鉛乳酸菌的分離和篩選23
• 2.2.1 樣品采集和耐鉛乳酸菌的分離23
• 2.2.2 耐鉛乳酸菌的表型鑒定23
• 2.2.3 耐鉛乳酸菌的穩(wěn)定性和耐受性23
• 2.3 耐鉛乳酸菌體外益生特性的測定23-25
• 2.3.1 強酸耐受試驗23-24
• 2.3.2 耐膽鹽試驗24
• 2.3.3 耐胰蛋白酶試驗24
• 2.3.4 抑菌試驗24
• 2.3.5 耐鉛乳酸菌體外抗氧化試驗24-25
• 2.4 耐鉛乳酸菌藥敏試驗25-26
• 2.5 耐鉛乳酸菌對鉛的吸附試驗26
• 2.6 耐鉛乳酸菌分子生物學鑒定26
• 2.7 動物試驗26-27
• 2.7.1 小鼠醋酸鉛半數(shù)致死量的確定26-27
• 2.7.2 試驗設計27
• 2.8 樣品采集27-28
• 2.8.1 糞便樣品采集27
• 2.8.2 組織樣品采集27-28
• 2.9 樣品處理28
• 2.9.1 RNA處理28
• 2.9.2 蛋白樣品的處理28
• 2.10 檢測指標28-30
• 2.10.1 體重變化監(jiān)測28
• 2.10.2 病理變化檢測28-29
• 2.10.3 鉛含量檢測29
• 2.10.4 抗氧化指標檢測29
• 2.10.5 mRNA表達水平檢測29
• 2.10.6 P38 MAPK和NF-κB信號通路相關蛋白表達檢測29-30
• 2.11 數(shù)據(jù)分析30-31
• 3 結果31-60
• 3.1 耐鉛乳酸菌的篩選結果31
• 3.1.1 耐鉛乳酸菌的表型特征31
• 3.1.2 耐鉛乳酸菌的鉛耐受性與穩(wěn)定性31
• 3.2 耐鉛乳酸菌益生性質測定結果31-33
• 3.2.1 強酸耐受性質測定結果31
• 3.2.2 膽鹽耐受性質測定結果31
• 3.2.3 胰蛋白酶耐受性質測定結果31-32
• 3.2.4 抑制細菌能力測定結果32
• 3.2.5 體外抗氧化試驗結果32-33
• 3.3 耐鉛乳酸菌藥敏試驗結果33
• 3.4 耐性乳酸菌對鉛的吸附試驗結果33
• 3.5 分離菌株的分子生物學鑒定結果33-34
• 3.6 動物試驗34-60
• 3.6.1 鉛對小鼠半數(shù)致死量的測定34
• 3.6.2 體重的檢測結果34-35
• 3.6.3 病理學觀察結果35-39
• 3.6.4 體內殘留鉛含量的檢測結果39-42
• 3.6.5 各組織中抗氧化能力檢測結果42-45
• 3.6.6 mRNA表達檢測結果45-55
• 3.6.7 P38 MAPK和NF-κB信號通路相關蛋白表達檢測結果55-60
• 4 討論60-66
• 4.1 課題設計思路60
• 4.2 乳酸菌的益生特性60-61
• 4.3 乳酸菌對機體的保護作用61-65
• 4.3.1 乳酸菌緩解鉛毒性導致的病理損傷61-62
• 4.3.2 乳酸菌緩解鉛毒性導致的氧化應激62-63
• 4.3.3 乳酸菌緩解鉛毒性導致的炎癥反應63
• 4.3.4 乳酸菌調節(jié)腸道粘膜屏障相關細胞因子表達63-64
• 4.3.5 乳酸菌緩解鉛毒性導致的炎癥相關信號通路相關蛋白表達64-65
• 4.4 展望65-66
• 5 結論66-67
• 致謝67-68
• 參考文獻68-75
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文75

  本文關鍵詞：動物腸道源抗鉛益生乳酸菌的分離、鑒定及其緩解鉛毒性的機理研究

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本文編號：511139