本文關(guān)鍵詞：姜黃素抑制單增李斯特菌溶血素活性的分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：單增李斯特菌是一種重要的兼性厭氧、人獸共患胞內(nèi)寄生菌,是李斯特菌病的致病菌。單增李斯特菌主要感染老人、孕婦及免疫力低下的人�，F(xiàn)階段臨床治療單增李斯特菌感染疾病采用的是高劑量的抗生素療法,然而,無論早期是否使用抗生素治療,單增李斯特菌感染所引起的死亡率均高達(dá)30%。隨著單增李斯特菌感染在全球范圍內(nèi)的不斷爆發(fā)以及耐藥性菌株的不斷出現(xiàn),使得單增李斯特菌感染成為嚴(yán)重的危害公共衛(wèi)生的重要問題。作為胞內(nèi)寄生菌,單增李斯特菌可分泌多種毒力因子介導(dǎo)細(xì)菌的細(xì)胞毒性。該病原菌可侵襲包括吞噬細(xì)胞及非吞噬細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞。內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞后,細(xì)菌從吞噬泡逃入細(xì)胞的胞漿內(nèi),利用其所分泌的毒力因子Actin A,招募宿主細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白(F-Actin)獲得運(yùn)動(dòng)性并在胞漿內(nèi)進(jìn)行復(fù)制,隨后感染鄰近的細(xì)胞,在穿入鄰近細(xì)胞的雙層吞噬泡后,利用自身分泌的單增李斯特菌溶血素(Listeriolysin O,LLO)及PLCs(PIPLC及PCPLC),逃到吞噬泡外。值得一提的是,如果單增李斯特菌不能從吞噬泡內(nèi)逃出,活化的巨噬細(xì)胞可以通過分泌ROS及NOS有效降解胞內(nèi)的單增李斯特菌。單增李斯特菌逃入胞漿后又開始了下一輪的復(fù)制、感染。至此,單增李斯特菌就完成了其不暴露在宿主細(xì)胞外的生命循環(huán)。單增李斯特菌所分泌的LLO對(duì)其胞內(nèi)的生存具有重要意義。多種研究表明,缺乏LLO,單增李斯特菌將被困在吞噬泡內(nèi),胞內(nèi)增殖的單增李斯特菌數(shù)會(huì)顯著降低。同樣的與野生株相比,LLO敲除株感染小鼠的靶器官內(nèi)的菌落定殖數(shù)顯著低于野生株,幾乎不會(huì)引起小鼠的死亡及組織損傷,LLO在單增李斯特菌感染中的重要作用使得該毒力因子成為抗單增李斯特菌感染的潛在藥物靶點(diǎn)。在本篇文章中,我們應(yīng)用溶血實(shí)驗(yàn),篩選到了楊梅黃酮、黃芩素、桑色素、白楊素、柚皮素這5種黃酮類化合物可通過作用于LLO的第四結(jié)構(gòu)域,影響LLO寡聚體形成而直接抑制其溶血活性。因?yàn)樗幬镒饔眯Чc其結(jié)構(gòu)存在著緊密的聯(lián)系,因此我們猜想是否有其他類型的化合物可通過不同的機(jī)制抑制LLO的成孔活性,通過篩選,我們發(fā)現(xiàn)酸性多酚類化合物姜黃素(Curcumin),也可以有效抑制LLO的溶血活性。對(duì)單增李斯特菌多引起的細(xì)胞死亡也有保護(hù)效果,我們對(duì)其抑制LLO溶血活性的機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步研究。溶血的結(jié)果提示我們,姜黃素可以抑制LLO的成孔活性,因此在細(xì)胞中,很有可能可以抑制LLO從吞噬泡內(nèi)的逃逸,減少胞內(nèi)的單增李斯特菌數(shù)。胞內(nèi)生長(zhǎng)曲線的結(jié)果顯示,姜黃素可以劑量依賴式降低胞內(nèi)的單增李斯特菌數(shù)。我們使用免疫熒光染色的方法,分別用單增李斯特菌(MOI為2.5)與姜黃共同作用感染J774細(xì)胞,取0.5 h、3 h及5 h時(shí)進(jìn)行固定、染色并觀察。結(jié)果顯示,在0.5 h時(shí)候,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的單增李斯特菌數(shù)無顯著差異,結(jié)果提示,姜黃素幾乎不影響單增李斯特菌內(nèi)化進(jìn)入胞內(nèi)。3 h固定染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),姜黃素可以顯著降低逃逸的單增李斯特菌數(shù),單增李斯特菌野生株EGD組的逃逸率為56.71%,溶血素敲除株EGDΔhly的逃逸率為0%,EGD+Curcumin組的逃逸率為23.94%。結(jié)果提示,姜黃素確實(shí)是通過抑制LLO的活性發(fā)揮保護(hù)作用的。在侵襲細(xì)胞5 h后,細(xì)菌已開始大量增殖逃逸,免疫熒光染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,姜黃素可以顯著降低胞內(nèi)的單增李斯特菌數(shù)目。使用PI和SYTO 9染色評(píng)價(jià)了巨噬細(xì)胞內(nèi)單增李斯特菌的狀態(tài),結(jié)果顯示,姜黃素處理后胞內(nèi)活菌數(shù)由96.7%下降到37.29%,提示我們,姜黃素處理后有利于巨噬細(xì)胞殺死胞內(nèi)的單增李斯特菌。姜黃素在小鼠感染單增李斯特菌模型中也顯示出了良好的治療效果。姜黃素處理后,顯著降低單增李斯特菌定殖靶器官(肝臟和脾臟)內(nèi)的菌落數(shù),緩解了靶器官的病理?yè)p傷,降低了小鼠的死亡率。為了進(jìn)一步確定姜黃素抑制LLO活性的機(jī)制,我們使用計(jì)算生物學(xué)方法模擬出姜黃素與LLO的潛在結(jié)合位點(diǎn)為V100和L503。不同于我們篩選到的5種黃酮類化合物,姜黃素通過結(jié)合在LLO的D3和D4結(jié)構(gòu)域之間,影響了LLO寡聚體的形成。為了驗(yàn)證計(jì)算生物學(xué)模擬的結(jié)果,我們將上述兩個(gè)位點(diǎn)突變后,進(jìn)行了溶血實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,姜黃素抑制LLO突變蛋白V100A及L503A溶血作用的能力顯著下降。與此結(jié)果相似,LDH釋放結(jié)果顯示,姜黃素對(duì)突變蛋白所引起的細(xì)胞的保護(hù)效果也顯著下降。結(jié)果提示,V100和L503確實(shí)是姜黃素與LLO結(jié)合的重要位點(diǎn)。膜結(jié)合實(shí)驗(yàn)與LLO寡聚化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,姜黃素不影響LLO與細(xì)胞膜的結(jié)合,但可以減少LLO寡聚體形成。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,姜黃素可以通過降低LLO寡聚體的形成抑制LLO的溶血活性。研究結(jié)果表明,姜黃素是一種潛在的治療單增李斯特菌感染的藥物或者抗生素療法的輔助藥物。
【關(guān)鍵詞】：單增李斯特菌 單增李斯特菌溶血素 姜黃素 抗感染
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要4-6
• abstract6-12
• 前言12-14
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述14-23
• 第一章 單增李斯特菌研究進(jìn)展概述14-16
• 1.1 微生物學(xué)14
• 1.2 流行病學(xué)14-15
• 1.3 發(fā)病機(jī)制15
• 1.4 臨床表現(xiàn)15-16
• 第二章 單增李斯特菌毒力因子概述16-21
• 2.1 內(nèi)化素17
• 2.2 溶血素17-19
• 2.3 Actin A19-21
• 第三章 姜黃素研究進(jìn)展21-23
• 3.1 抗氧化活性21
• 3.2 抗炎活性21-22
• 3.3 抗癌活性22-23
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容23-57
• 第1章 天然抗單增李斯特菌溶血素藥物的篩選23-29
• 1.1 材料和方法23-25
• 1.2 結(jié)果25-27
• 1.3 討論27-28
• 1.4 小結(jié)28-29
• 第2章 姜黃素抑制單增李斯特菌從吞噬泡內(nèi)逃逸29-42
• 2.1 材料和方法29-34
• 2.2 結(jié)果34-39
• 2.3 討論39-40
• 2.4 小結(jié)40-42
• 第3章 姜黃素對(duì)單增李斯特菌感染小鼠的保護(hù)作用42-48
• 3.1 材料和方法42-44
• 3.2 結(jié)果44-46
• 3.3 討論46
• 3.4 小結(jié)46-48
• 第4章 姜黃素抑制單增李斯特菌溶血素的分子機(jī)制研究48-57
• 4.1 材料方法48-51
• 4.2 結(jié)果51-55
• 4.3 討論55-56
• 4.4 小結(jié)56-57
• 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-66
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介66-68
• 作者簡(jiǎn)介68-69
• 碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文69-70
• 致謝70

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王建鋒;抗單核細(xì)胞增多性李斯特菌溶血素化合物的發(fā)現(xiàn)及作用機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：姜黃素抑制單增李斯特菌溶血素活性的分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：505137