本文關鍵詞：姜黃素抑制單增李斯特菌溶血素活性的分子機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：單增李斯特菌是一種重要的兼性厭氧、人獸共患胞內寄生菌,是李斯特菌病的致病菌。單增李斯特菌主要感染老人、孕婦及免疫力低下的人。現(xiàn)階段臨床治療單增李斯特菌感染疾病采用的是高劑量的抗生素療法,然而,無論早期是否使用抗生素治療,單增李斯特菌感染所引起的死亡率均高達30%。隨著單增李斯特菌感染在全球范圍內的不斷爆發(fā)以及耐藥性菌株的不斷出現(xiàn),使得單增李斯特菌感染成為嚴重的危害公共衛(wèi)生的重要問題。作為胞內寄生菌,單增李斯特菌可分泌多種毒力因子介導細菌的細胞毒性。該病原菌可侵襲包括吞噬細胞及非吞噬細胞在內的多種細胞。內化進入細胞后,細菌從吞噬泡逃入細胞的胞漿內,利用其所分泌的毒力因子Actin A,招募宿主細胞的肌動蛋白(F-Actin)獲得運動性并在胞漿內進行復制,隨后感染鄰近的細胞,在穿入鄰近細胞的雙層吞噬泡后,利用自身分泌的單增李斯特菌溶血素(Listeriolysin O,LLO)及PLCs(PIPLC及PCPLC),逃到吞噬泡外。值得一提的是,如果單增李斯特菌不能從吞噬泡內逃出,活化的巨噬細胞可以通過分泌ROS及NOS有效降解胞內的單增李斯特菌。單增李斯特菌逃入胞漿后又開始了下一輪的復制、感染。至此,單增李斯特菌就完成了其不暴露在宿主細胞外的生命循環(huán)。單增李斯特菌所分泌的LLO對其胞內的生存具有重要意義。多種研究表明,缺乏LLO,單增李斯特菌將被困在吞噬泡內,胞內增殖的單增李斯特菌數(shù)會顯著降低。同樣的與野生株相比,LLO敲除株感染小鼠的靶器官內的菌落定殖數(shù)顯著低于野生株,幾乎不會引起小鼠的死亡及組織損傷,LLO在單增李斯特菌感染中的重要作用使得該毒力因子成為抗單增李斯特菌感染的潛在藥物靶點。在本篇文章中,我們應用溶血實驗,篩選到了楊梅黃酮、黃芩素、桑色素、白楊素、柚皮素這5種黃酮類化合物可通過作用于LLO的第四結構域,影響LLO寡聚體形成而直接抑制其溶血活性。因為藥物作用效果與其結構存在著緊密的聯(lián)系,因此我們猜想是否有其他類型的化合物可通過不同的機制抑制LLO的成孔活性,通過篩選,我們發(fā)現(xiàn)酸性多酚類化合物姜黃素(Curcumin),也可以有效抑制LLO的溶血活性。對單增李斯特菌多引起的細胞死亡也有保護效果,我們對其抑制LLO溶血活性的機制進行了進一步研究。溶血的結果提示我們,姜黃素可以抑制LLO的成孔活性,因此在細胞中,很有可能可以抑制LLO從吞噬泡內的逃逸,減少胞內的單增李斯特菌數(shù)。胞內生長曲線的結果顯示,姜黃素可以劑量依賴式降低胞內的單增李斯特菌數(shù)。我們使用免疫熒光染色的方法,分別用單增李斯特菌(MOI為2.5)與姜黃共同作用感染J774細胞,取0.5 h、3 h及5 h時進行固定、染色并觀察。結果顯示,在0.5 h時候,進入細胞內的單增李斯特菌數(shù)無顯著差異,結果提示,姜黃素幾乎不影響單增李斯特菌內化進入胞內。3 h固定染色結果發(fā)現(xiàn),姜黃素可以顯著降低逃逸的單增李斯特菌數(shù),單增李斯特菌野生株EGD組的逃逸率為56.71%,溶血素敲除株EGDΔhly的逃逸率為0%,EGD+Curcumin組的逃逸率為23.94%。結果提示,姜黃素確實是通過抑制LLO的活性發(fā)揮保護作用的。在侵襲細胞5 h后,細菌已開始大量增殖逃逸,免疫熒光染色統(tǒng)計結果顯示,姜黃素可以顯著降低胞內的單增李斯特菌數(shù)目。使用PI和SYTO 9染色評價了巨噬細胞內單增李斯特菌的狀態(tài),結果顯示,姜黃素處理后胞內活菌數(shù)由96.7%下降到37.29%,提示我們,姜黃素處理后有利于巨噬細胞殺死胞內的單增李斯特菌。姜黃素在小鼠感染單增李斯特菌模型中也顯示出了良好的治療效果。姜黃素處理后,顯著降低單增李斯特菌定殖靶器官(肝臟和脾臟)內的菌落數(shù),緩解了靶器官的病理損傷,降低了小鼠的死亡率。為了進一步確定姜黃素抑制LLO活性的機制,我們使用計算生物學方法模擬出姜黃素與LLO的潛在結合位點為V100和L503。不同于我們篩選到的5種黃酮類化合物,姜黃素通過結合在LLO的D3和D4結構域之間,影響了LLO寡聚體的形成。為了驗證計算生物學模擬的結果,我們將上述兩個位點突變后,進行了溶血實驗,結果顯示,姜黃素抑制LLO突變蛋白V100A及L503A溶血作用的能力顯著下降。與此結果相似,LDH釋放結果顯示,姜黃素對突變蛋白所引起的細胞的保護效果也顯著下降。結果提示,V100和L503確實是姜黃素與LLO結合的重要位點。膜結合實驗與LLO寡聚化實驗結果顯示,姜黃素不影響LLO與細胞膜的結合,但可以減少LLO寡聚體形成。以上實驗結果表明,姜黃素可以通過降低LLO寡聚體的形成抑制LLO的溶血活性。研究結果表明,姜黃素是一種潛在的治療單增李斯特菌感染的藥物或者抗生素療法的輔助藥物。
【關鍵詞】：單增李斯特菌 單增李斯特菌溶血素 姜黃素 抗感染
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要4-6
• abstract6-12
• 前言12-14
• 第一篇 文獻綜述14-23
• 第一章 單增李斯特菌研究進展概述14-16
• 1.1 微生物學14
• 1.2 流行病學14-15
• 1.3 發(fā)病機制15
• 1.4 臨床表現(xiàn)15-16
• 第二章 單增李斯特菌毒力因子概述16-21
• 2.1 內化素17
• 2.2 溶血素17-19
• 2.3 Actin A19-21
• 第三章 姜黃素研究進展21-23
• 3.1 抗氧化活性21
• 3.2 抗炎活性21-22
• 3.3 抗癌活性22-23
• 第二篇 研究內容23-57
• 第1章 天然抗單增李斯特菌溶血素藥物的篩選23-29
• 1.1 材料和方法23-25
• 1.2 結果25-27
• 1.3 討論27-28
• 1.4 小結28-29
• 第2章 姜黃素抑制單增李斯特菌從吞噬泡內逃逸29-42
• 2.1 材料和方法29-34
• 2.2 結果34-39
• 2.3 討論39-40
• 2.4 小結40-42
• 第3章 姜黃素對單增李斯特菌感染小鼠的保護作用42-48
• 3.1 材料和方法42-44
• 3.2 結果44-46
• 3.3 討論46
• 3.4 小結46-48
• 第4章 姜黃素抑制單增李斯特菌溶血素的分子機制研究48-57
• 4.1 材料方法48-51
• 4.2 結果51-55
• 4.3 討論55-56
• 4.4 小結56-57
• 結論57-58
• 參考文獻58-66
• 導師簡介66-68
• 作者簡介68-69
• 碩士期間發(fā)表的學術論文69-70
• 致謝70

【參考文獻】

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王建鋒;抗單核細胞增多性李斯特菌溶血素化合物的發(fā)現(xiàn)及作用機制研究[D];吉林大學;2015年

  本文關鍵詞：姜黃素抑制單增李斯特菌溶血素活性的分子機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：505137