本文關(guān)鍵詞：BoHV-5 miR-B10-3p誘餌系統(tǒng)的建立及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度大約在22 nt的沒有編碼功能的單鏈RNA分子,以堿基不完全配對(duì)或完全配對(duì)的方式結(jié)合靶m RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平調(diào)控基因表達(dá)。miRNA在生物的幾乎所有生理過程和病理過程中發(fā)揮重要的作用,包括胚胎發(fā)育、組織生長(zhǎng)或再生、干細(xì)胞分化、癌癥發(fā)生及許多免疫反應(yīng)。牛皰疹病毒5型(Bovine herpesvirus 5,BoHV-5)是α皰疹病毒中的重要成員,有嗜神經(jīng)性和潛伏感染的特性,使養(yǎng)殖業(yè)蒙受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在本課題組前期的研究中,借鑒高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,并驗(yàn)證在BoHV-5病毒的基因能夠產(chǎn)生16個(gè)成熟的miRNA。其中BoHV-5 miR-B10的表達(dá)豐度最高,并且我們通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè),結(jié)果顯示UL39可能受到該miRNA調(diào)控。然而編碼miR-B10的基因位于BoHV-5基因組的末端重復(fù)區(qū)內(nèi),在基因組上有兩個(gè)編碼位點(diǎn),因此要研究該miRNA的功能不能單純的在對(duì)該編碼位點(diǎn)直接進(jìn)行缺失。在本研究中,我們首先驗(yàn)證了BoHV-5 miR-B10-3p與病毒自身的基因UL39的3′UTR區(qū)域的互作關(guān)系。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了BoHV-5 miR-B10-3p對(duì)UL39的3'UTR區(qū)域有下調(diào)作用后,我們建立了可調(diào)控的體內(nèi)miRNA knock-down系統(tǒng)。該系統(tǒng)由可誘導(dǎo)的調(diào)控元件以及特異性吸附miRNA的元件兩個(gè)部分構(gòu)成。同時(shí)我們構(gòu)建了能夠反映miRNA相對(duì)含量的報(bào)告系統(tǒng),對(duì)miRNA的量以及miRNA konck-down系統(tǒng)的效率進(jìn)行驗(yàn)證,最終把miRNA knock-down系統(tǒng)整合到病毒基因組上,構(gòu)建了含誘導(dǎo)表“miRNA誘餌”表達(dá)元件的重組病毒,抑制BoHV-5 miR-B10-3p的表達(dá),進(jìn)而研究這個(gè)miRNA的功能,并試圖從miRNA角度闡釋BoHV-5的神經(jīng)致病機(jī)理,也可能為研制新型疫苗和藥物提供新的思路和技術(shù)平臺(tái)。本研究的主要內(nèi)容如下:1.BoHV-5 miR-B10-3p與其靶基因UL39的3'UTR互作驗(yàn)證把靶基因UL39的3'UTR序列克隆到上熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒海腎熒光的多克隆位點(diǎn)區(qū)域,然后把BoHV-5 miR-B10-3 mimics和報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中,24小時(shí)后進(jìn)行雙熒光素酶分析,結(jié)果顯示BoHV-5 miR-B10-3p能與其靶基因UL39的3'UTR區(qū)互作,并有顯著的下調(diào)作用。2.構(gòu)建含miRNA誘餌系統(tǒng)的質(zhì)粒我們把Tet-on調(diào)控系統(tǒng)與能夠吸附特異miRNA的誘餌元件(Tough Decoy,Tu D)串聯(lián)起來實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA誘餌的可控表達(dá)。具體是把三個(gè)Tu D元件插入到EGFP的3'UTR區(qū)域,用Tet-on調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控EGFP基因表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Tu D元件的可控表達(dá)。3.構(gòu)建含miRNA誘餌系統(tǒng)的重組病毒本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用同源重組的原理,將構(gòu)建好的含有基因組插入位點(diǎn)上下游同源臂的誘餌系統(tǒng)中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和BoHV-5基因組以及輔助轉(zhuǎn)移質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染與細(xì)胞內(nèi),挑取含有熒光標(biāo)記的重組型病毒經(jīng)過空斑純化篩選獲取含miRNA誘餌系統(tǒng)的重組病毒。4.重組病毒miRNA誘餌系統(tǒng)功能的驗(yàn)證我們主要通過兩個(gè)方面對(duì)誘餌系統(tǒng)的功能進(jìn)行驗(yàn)證,一方面是重組病毒的生物學(xué)特性的研究,通過生物學(xué)特性的變化直接反映誘餌系統(tǒng)的效果;另一方面是通過熒光定量PCR和western blot對(duì)knock down相應(yīng)miRNA后的效果進(jìn)行定量檢測(cè)�？偠灾�,本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)BoHV-5 miR-B10-3p能與其靶基因UL39的3'UTR區(qū)互作,并且起下調(diào)作用。(2)miRNA報(bào)告系統(tǒng)能特異性的報(bào)告相應(yīng)miRNA的含量。(3)含有miRNA誘餌系統(tǒng)的重組病毒knock down相應(yīng)的miRNA后病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖減慢。(4)BoHV5 miR-B10-3p誘餌系統(tǒng)的下調(diào)效率約為50%。
【關(guān)鍵詞】：牛皰疹病毒5型 microRNA TuD Tet-on
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 縮略語表(Abbreviation)10-11
• 第1章 文獻(xiàn)綜述11-19
• 引言11
• 1.1 牛皰疹病毒5型（BoHV-5）的流行特性以及分子特性11-12
• 1.2 miRNA的生成機(jī)制及功能12-13
• 1.3 皰疹病毒表達(dá)的miRNA13-14
• 1.4 miRNA的功能研究14-15
• 1.5 miRNA誘餌15-17
• 1.6 四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)17-18
• 1.7 研究目的與意義18-19
• 第2章 材料與方法19-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-24
• 2.1.1 載體、質(zhì)粒、病毒、細(xì)胞、菌種及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物19
• 2.1.2 主要試劑19-20
• 2.1.3 主要溶液及培養(yǎng)基的配制20-23
• 2.1.4 本研究中所用的寡核苷酸引物23-24
• 2.2 試驗(yàn)方法24-35
• 2.2.1 PCR擴(kuò)增方法24
• 2.2.2 DNA純化分離的方法24-27
• 2.2.3 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)27
• 2.2.4 酶切后連接以及同源重組27
• 2.2.5 大腸桿菌感受態(tài)制備的方法27-28
• 2.2.6 轉(zhuǎn)化28
• 2.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染28-29
• 2.2.8 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)29-30
• 2.2.9 RNA的抽提30
• 2.2.10 RNA的質(zhì)量鑒定30-31
• 2.2.11 反轉(zhuǎn)錄與qPCR31-32
• 2.2.12 Western blot32-33
• 2.2.13 病毒滴度（PFU）的測(cè)定33-34
• 2.2.14 空斑篩選純化34
• 2.2.15 空斑大小比較34
• 2.2.16 一步法生長(zhǎng)曲線34-35
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-48
• 3.1 miR-B10-3p與病毒自身靶基因UL39的 3’UTR互作驗(yàn)證35
• 3.2 miRNA報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建以及功能的驗(yàn)證35-37
• 3.2.1 miRNA報(bào)告系統(tǒng)的設(shè)計(jì)35-36
• 3.2.2 miRNA報(bào)告系統(tǒng)功能的驗(yàn)證36
• 3.2.3 miRNA報(bào)告系統(tǒng)特異性的驗(yàn)證36-37
• 3.3 miRNA誘餌系統(tǒng)的構(gòu)建37-40
• 3.4 含誘餌系統(tǒng)的重組病毒的構(gòu)建40-44
• 3.4.1 含上下游同源臂的質(zhì)粒構(gòu)建40-41
• 3.4.2 中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定41-42
• 3.4.3 同源重組42
• 3.4.4 含誘餌系統(tǒng)的重組病毒的純化以及鑒定42-44
• 3.5 重組病毒體外培養(yǎng)生物特性的研究44-46
• 3.5.1 空斑大小的比較44-45
• 3.5.2 一步法生長(zhǎng)曲線45-46
• 3.6 重組病毒中誘餌系統(tǒng)的功能驗(yàn)證46-48
• 3.6.1 檢測(cè)EGFP的表達(dá)量46-47
• 3.6.2 TaqMan法絕對(duì)定量qPCR檢測(cè)誘餌系統(tǒng)對(duì)miRNA的吸附作用47-48
• 第4章 討論與結(jié)論48-52
• 4.1 關(guān)于誘餌系統(tǒng)質(zhì)粒的構(gòu)建48-50
• 4.2 關(guān)于構(gòu)建重組病毒50
• 4.3 關(guān)于病毒miRNA誘餌系統(tǒng)效率的檢測(cè)50-51
• 4.4 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 致謝58

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