本文關(guān)鍵詞：毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與篩選及3-1E基因的克隆表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：雞球蟲病是由一種或數(shù)種艾美耳球蟲寄生于雞消化道上皮細(xì)胞內(nèi)而引起的一種原蟲寄生蟲病,嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)。目前,球蟲病的防治主要依賴化學(xué)藥物或雞球蟲病活疫苗,雖然人們采取了穿梭用藥、輪換用藥、聯(lián)合用藥等各種措施,但球蟲幾乎對(duì)所有使用過(guò)的抗球蟲藥物均出現(xiàn)了耐藥性。雞球蟲病活疫苗有著較強(qiáng)的免疫效果,但存在一些突出的問(wèn)題,如有擴(kuò)散病原的風(fēng)險(xiǎn)、疫苗接種劑量難以控制、影響飼料報(bào)酬等。因此,雞球蟲保護(hù)性抗原基因的篩選與克隆表達(dá)及其免疫保護(hù)力的研究一直是雞球蟲病研究的熱點(diǎn)。毒害艾美耳球蟲(Eimeria necatrix)是雞球蟲病的重要病原,在臨床上常危害8～18周齡的雞,引起雞的急性小腸球蟲病。迄今,從毒害艾美耳球蟲克隆的抗原基因甚少。為此,本研究應(yīng)用SMART技術(shù)構(gòu)建了毒害艾美耳球蟲(E. necatrix)第二代裂殖子cDNA文庫(kù),并用免疫學(xué)方法從文庫(kù)中篩選抗原基因,并對(duì)3-1E基因進(jìn)行了克隆表達(dá)和免疫原性分析,為研究毒害艾美耳球蟲亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。1毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子的分離純化28日齡無(wú)球蟲雛雞,每雞經(jīng)嗉囊感染20000個(gè)毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊。感染150 h后撲殺、剖檢雞,刮取小腸中段腸黏膜組織,研磨后用1 mmol/L透明質(zhì)酸酶消化,釋放裂殖子；隨后經(jīng)4層棉紗布、260目錦綸篩兜和17 μm PET膜過(guò)濾,濾液經(jīng)離心洗滌后用裂解液裂解紅細(xì)胞；最后用30%和50%的Percoll,5200rpm離心15 min,分離純化裂殖子。結(jié)果表明,該方法操作程序簡(jiǎn)單,分離效果好,獲得的裂殖子無(wú)雜質(zhì),其純度適用于分子生物學(xué)方面的研究。2毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫(kù)的構(gòu)建用Trizol試劑提取毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子總RNA,用oliogo (dT)磁珠法純化mRNA,隨后采用SMART技術(shù)構(gòu)建了毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA噬菌體表達(dá)文庫(kù)。經(jīng)鑒定,原始文庫(kù)庫(kù)容量2.14×106pfu/mL,擴(kuò)增后的庫(kù)容量約為4.47×1010pfu/mL,擴(kuò)增后的文庫(kù)重組率為90%：隨機(jī)挑取100個(gè)單克隆,通過(guò)菌液PCR檢測(cè)得知文庫(kù)插入片段長(zhǎng)度以400 bp～1000 bp為主。結(jié)果顯示,構(gòu)建的cDNA噬菌體表達(dá)文庫(kù)達(dá)到SMART高質(zhì)量文庫(kù)指標(biāo)。3毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫(kù)的篩選首先,用毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊經(jīng)嗉囊感染雛雞,制備抗毒害艾美耳球蟲的雞康復(fù)血清；用純化的毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子可溶性蛋白為抗原免疫小鼠,制備鼠抗毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子多抗血清；兩種血清經(jīng)ELISA檢測(cè),顯示兩種多抗均有很高的效價(jià)；隨后,按試劑盒規(guī)定方法,用雞康復(fù)血清和鼠抗代裂殖子血清對(duì)構(gòu)建的cDNA文庫(kù)進(jìn)行免疫學(xué)篩選,經(jīng)初篩分別獲得出11個(gè)和7個(gè)陽(yáng)性克隆,其中有5個(gè)克隆為雙陽(yáng)性；接著,對(duì)5個(gè)雙陽(yáng)性克隆進(jìn)行復(fù)篩直至整個(gè)膜上均為陽(yáng)性克隆為止；最后,對(duì)復(fù)篩后獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定,其PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序,對(duì)獲得的EST序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示,5個(gè)EST序列的長(zhǎng)度分別為599、723、516、939和899bp,編碼的蛋白分別與毒害艾美耳球蟲假定蛋白,日本血吸蟲SJCHGC02770蛋白、SJCHGC00839蛋白和SJCHGC 09095蛋白,柔嫩艾美耳球蟲核糖體蛋白P2,毒害艾美耳球蟲60S核糖體蛋白L8和柔嫩艾美耳球蟲50S核糖體蛋白L2,以及巨型艾美耳球蟲Ⅰ型細(xì)胞色素氧化酶有很高的同源性。4毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子3-1E基因的克隆表達(dá)首先,根據(jù)堆型艾美耳球蟲子孢子3-1E基因序列設(shè)計(jì)引物,以毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子總RNA為模板,用RT-PCR方法擴(kuò)增基因片段；將目的片段插入到pGEM-T-Easy載體,常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a,藍(lán)白斑篩選后對(duì)經(jīng)酶切和PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。隨后,根據(jù)3-1E基因的ORF序列和質(zhì)粒pET-28a (+)酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,以重組質(zhì)粒pGEM-T-Easy-3-1E為模板擴(kuò)增出表達(dá)片段,將該片段與載體pET-28a (+)連接,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-3-1E,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。最后,分別以鼠抗重組蛋白多克隆抗體和毒害艾美耳球蟲感染雞康復(fù)血清為一抗進(jìn)行Western-blot檢測(cè)。結(jié)果顯示,克隆的毒害艾美耳球蟲3-1E基因全長(zhǎng)為671 bp,具有一個(gè)大小為513 bp的完整開放閱讀框,編碼170個(gè)氨基酸；表達(dá)產(chǎn)物大小約為36.47 kDa,主要以可溶性形式存在；重組蛋白分別能被鼠抗重組蛋白多克隆抗體和雞康復(fù)血清識(shí)別,顯示重組蛋白具有免疫原性。
【關(guān)鍵詞】：毒害艾美耳球蟲 第二代裂殖子 cDNA文庫(kù) 構(gòu)建與篩選 3-1E基因 克隆 原核表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.7
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-9
• 符號(hào)說(shuō)明9-11
• 前言11-12
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述12-23
• 一、cDNA文庫(kù)構(gòu)建及其在雞球蟲研究中的應(yīng)用12-17
• 1 cDNA文庫(kù)的類型12-14
• 2 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法14-16
• 3 cDNA文庫(kù)在克隆雞球蟲基因中的應(yīng)用16-17
• 二、雞球蟲病重組亞單位疫苗的研究進(jìn)展17-19
• 1 TA4基因17-18
• 2 p250基因18
• 3 3-1E基因18
• 4 SO7基因18
• 5 EtMIC-2基因18-19
• 6 Mzp5-7基因19
• 參考文獻(xiàn)19-23
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容23-66
• 第一章 毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子的分離與純化23-27
• 1 材料23-24
• 2 方法24
• 3 結(jié)果24-25
• 4 討論25-26
• 參考文獻(xiàn)26-27
• 第二章 毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫(kù)的構(gòu)建27-43
• 1 材料27-29
• 2 方法29-36
• 3 結(jié)果36-40
• 4 討論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-43
• 第三章：毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫(kù)的篩選43-54
• 1 材料43-44
• 2 方法44-48
• 3 結(jié)果48-52
• 4 討論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-54
• 第四章 毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子3-1E基因的克隆表達(dá)與免疫原性分析54-66
• 1 材料54-55
• 2 方法55-58
• 3 結(jié)果58-63
• 4 討論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-66
• 全文小結(jié)66-67
• 在讀期間發(fā)表的論文67-68
• 致謝68-69

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2 董輝,索勛,汪明;毒害艾美耳球蟲晚熟系生物學(xué)特性研究[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2003年06期

3 顧有方,薛文友,陳會(huì)良;飼料添加中草藥抗毒害艾美耳球蟲效果觀察[J];中國(guó)獸藥雜志;2005年01期

4 李峗;古少鵬;趙劍;;毒害艾美耳球蟲早熟株與親本株繁殖力的觀察[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2010年06期

5 侯金環(huán);李峗;趙劍;古少鵬;;毒害艾美耳球蟲早熟株的選育及內(nèi)生發(fā)育觀察[J];激光生物學(xué)報(bào);2010年01期

6 劉梅;劉丹丹;李建梅;王尚尚;程旭;沈欣悅;戴亞斌;陶建平;;不同日齡雞對(duì)毒害艾美耳球蟲的易感性研究[J];畜牧與獸醫(yī);2013年10期

7 董輝,索勛,騰可導(dǎo),汪明;毒害艾美耳球蟲晚熟系選育及其生活史研究[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2003年04期

8 何華西,王尚榮;中藥防治雞毒害艾美耳球蟲病的療效試驗(yàn)[J];中國(guó)獸醫(yī)寄生蟲病;2003年04期

9 林青,于三科,崔萍,鄭亞娟,何小剛,張松濤;毒害艾美耳球蟲致病性與抗藥性研究[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2004年06期

10 史宗勇;趙劍;李峗;史新濤;古少鵬;;毒害艾美耳球蟲早熟株致病性與繁殖力的研究[J];農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào);2011年05期

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1 劉立恒;盧雨婷;李麟;;福建某雞場(chǎng)毒害艾美耳球蟲病的診斷[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)——第二屆中國(guó)獸醫(yī)臨床大會(huì)論文集(下冊(cè))[C];2010年

2 顧有方;薛文有;陳會(huì)良;劉德義;金光明;李升和;;飼料添加中草藥抗毒害艾美耳球蟲效果觀察[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第五次代表大會(huì)暨第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

3 卞國(guó)志;蔡建平;謝明權(quán);翁亞標(biāo);覃宗華;葉秀華;;不同劑量和免疫次數(shù)對(duì)雞毒害艾美耳球蟲免疫保護(hù)力的影響[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第五次代表大會(huì)暨第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

4 劉梅;李建梅;劉丹丹;王尚尚;程旭;沈欣悅;戴亞斌;陶建平;;毒害艾美耳球蟲:一田間分離株的致病性與耐藥性分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

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9 董輝;;毒害艾美耳球蟲晚熟系選育及其生物學(xué)特性研究初探[A];中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)第七屆全國(guó)青年寄生蟲學(xué)工作者學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2002年

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1 劉丹丹;毒害艾美耳球蟲配子體抗原基因的克隆表達(dá)與功能研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2014年

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1 杜彩娟;毒害艾美耳球蟲子孢子cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與篩選[D];揚(yáng)州大學(xué);2016年

2 蔡秀清;毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與篩選及3-1E基因的克隆表達(dá)[D];揚(yáng)州大學(xué);2016年

3 閻雪飛;雞毒害艾美耳球蟲抗原NPmz19的免疫保護(hù)性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

4 劉紅霞;雞毒害艾美耳球蟲MIC5基因在大腸桿菌的重組表達(dá)產(chǎn)物抗原性分析[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

5 張娜;雞毒害艾美耳球蟲NA4基因免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫保護(hù)性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

6 胡京友;雛雞感染毒害艾美耳球蟲后IL-2和免疫功能的變化及機(jī)理[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

7 馬春霞;毒害艾美耳球蟲感染雛雞抗氧化損傷及其致病機(jī)制[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

8 劉晶;雛雞感染毒害艾美耳球蟲后血液和免疫器官免疫變化及機(jī)理[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

9 賈富勃;毒害艾美耳球蟲感染雛雞局部黏膜免疫變化及機(jī)理[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

  本文關(guān)鍵詞：毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與篩選及3-1E基因的克隆表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：498007