本文關(guān)鍵詞：毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫的構(gòu)建與篩選及3-1E基因的克隆表達，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：雞球蟲病是由一種或數(shù)種艾美耳球蟲寄生于雞消化道上皮細胞內(nèi)而引起的一種原蟲寄生蟲病,嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)。目前,球蟲病的防治主要依賴化學(xué)藥物或雞球蟲病活疫苗,雖然人們采取了穿梭用藥、輪換用藥、聯(lián)合用藥等各種措施,但球蟲幾乎對所有使用過的抗球蟲藥物均出現(xiàn)了耐藥性。雞球蟲病活疫苗有著較強的免疫效果,但存在一些突出的問題,如有擴散病原的風險、疫苗接種劑量難以控制、影響飼料報酬等。因此,雞球蟲保護性抗原基因的篩選與克隆表達及其免疫保護力的研究一直是雞球蟲病研究的熱點。毒害艾美耳球蟲(Eimeria necatrix)是雞球蟲病的重要病原,在臨床上常危害8～18周齡的雞,引起雞的急性小腸球蟲病。迄今,從毒害艾美耳球蟲克隆的抗原基因甚少。為此,本研究應(yīng)用SMART技術(shù)構(gòu)建了毒害艾美耳球蟲(E. necatrix)第二代裂殖子cDNA文庫,并用免疫學(xué)方法從文庫中篩選抗原基因,并對3-1E基因進行了克隆表達和免疫原性分析,為研究毒害艾美耳球蟲亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。1毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子的分離純化28日齡無球蟲雛雞,每雞經(jīng)嗉囊感染20000個毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊。感染150 h后撲殺、剖檢雞,刮取小腸中段腸黏膜組織,研磨后用1 mmol/L透明質(zhì)酸酶消化,釋放裂殖子；隨后經(jīng)4層棉紗布、260目錦綸篩兜和17 μm PET膜過濾,濾液經(jīng)離心洗滌后用裂解液裂解紅細胞；最后用30%和50%的Percoll,5200rpm離心15 min,分離純化裂殖子。結(jié)果表明,該方法操作程序簡單,分離效果好,獲得的裂殖子無雜質(zhì),其純度適用于分子生物學(xué)方面的研究。2毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫的構(gòu)建用Trizol試劑提取毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子總RNA,用oliogo (dT)磁珠法純化mRNA,隨后采用SMART技術(shù)構(gòu)建了毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA噬菌體表達文庫。經(jīng)鑒定,原始文庫庫容量2.14×106pfu/mL,擴增后的庫容量約為4.47×1010pfu/mL,擴增后的文庫重組率為90%：隨機挑取100個單克隆,通過菌液PCR檢測得知文庫插入片段長度以400 bp～1000 bp為主。結(jié)果顯示,構(gòu)建的cDNA噬菌體表達文庫達到SMART高質(zhì)量文庫指標。3毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫的篩選首先,用毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊經(jīng)嗉囊感染雛雞,制備抗毒害艾美耳球蟲的雞康復(fù)血清；用純化的毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子可溶性蛋白為抗原免疫小鼠,制備鼠抗毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子多抗血清；兩種血清經(jīng)ELISA檢測,顯示兩種多抗均有很高的效價；隨后,按試劑盒規(guī)定方法,用雞康復(fù)血清和鼠抗代裂殖子血清對構(gòu)建的cDNA文庫進行免疫學(xué)篩選,經(jīng)初篩分別獲得出11個和7個陽性克隆,其中有5個克隆為雙陽性；接著,對5個雙陽性克隆進行復(fù)篩直至整個膜上均為陽性克隆為止；最后,對復(fù)篩后獲得的陽性克隆進行PCR鑒定,其PCR產(chǎn)物送公司測序,對獲得的EST序列進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示,5個EST序列的長度分別為599、723、516、939和899bp,編碼的蛋白分別與毒害艾美耳球蟲假定蛋白,日本血吸蟲SJCHGC02770蛋白、SJCHGC00839蛋白和SJCHGC 09095蛋白,柔嫩艾美耳球蟲核糖體蛋白P2,毒害艾美耳球蟲60S核糖體蛋白L8和柔嫩艾美耳球蟲50S核糖體蛋白L2,以及巨型艾美耳球蟲Ⅰ型細胞色素氧化酶有很高的同源性。4毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子3-1E基因的克隆表達首先,根據(jù)堆型艾美耳球蟲子孢子3-1E基因序列設(shè)計引物,以毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子總RNA為模板,用RT-PCR方法擴增基因片段；將目的片段插入到pGEM-T-Easy載體,常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a,藍白斑篩選后對經(jīng)酶切和PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進行測序。隨后,根據(jù)3-1E基因的ORF序列和質(zhì)粒pET-28a (+)酶切位點設(shè)計引物,以重組質(zhì)粒pGEM-T-Easy-3-1E為模板擴增出表達片段,將該片段與載體pET-28a (+)連接,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-28a-3-1E,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,用IPTG誘導(dǎo)表達,對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳分析。最后,分別以鼠抗重組蛋白多克隆抗體和毒害艾美耳球蟲感染雞康復(fù)血清為一抗進行Western-blot檢測。結(jié)果顯示,克隆的毒害艾美耳球蟲3-1E基因全長為671 bp,具有一個大小為513 bp的完整開放閱讀框,編碼170個氨基酸；表達產(chǎn)物大小約為36.47 kDa,主要以可溶性形式存在；重組蛋白分別能被鼠抗重組蛋白多克隆抗體和雞康復(fù)血清識別,顯示重組蛋白具有免疫原性。
【關(guān)鍵詞】：毒害艾美耳球蟲 第二代裂殖子 cDNA文庫 構(gòu)建與篩選 3-1E基因 克隆 原核表達
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-9
• 符號說明9-11
• 前言11-12
• 第一篇 文獻綜述12-23
• 一、cDNA文庫構(gòu)建及其在雞球蟲研究中的應(yīng)用12-17
• 1 cDNA文庫的類型12-14
• 2 cDNA文庫的構(gòu)建方法14-16
• 3 cDNA文庫在克隆雞球蟲基因中的應(yīng)用16-17
• 二、雞球蟲病重組亞單位疫苗的研究進展17-19
• 1 TA4基因17-18
• 2 p250基因18
• 3 3-1E基因18
• 4 SO7基因18
• 5 EtMIC-2基因18-19
• 6 Mzp5-7基因19
• 參考文獻19-23
• 第二篇 研究內(nèi)容23-66
• 第一章 毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子的分離與純化23-27
• 1 材料23-24
• 2 方法24
• 3 結(jié)果24-25
• 4 討論25-26
• 參考文獻26-27
• 第二章 毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫的構(gòu)建27-43
• 1 材料27-29
• 2 方法29-36
• 3 結(jié)果36-40
• 4 討論40-41
• 參考文獻41-43
• 第三章：毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫的篩選43-54
• 1 材料43-44
• 2 方法44-48
• 3 結(jié)果48-52
• 4 討論52-53
• 參考文獻53-54
• 第四章 毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子3-1E基因的克隆表達與免疫原性分析54-66
• 1 材料54-55
• 2 方法55-58
• 3 結(jié)果58-63
• 4 討論63-64
• 參考文獻64-66
• 全文小結(jié)66-67
• 在讀期間發(fā)表的論文67-68
• 致謝68-69

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