本文關(guān)鍵詞：三種牛泰勒蟲的實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：牛泰勒蟲是寄生在牛體淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)的一種蜱傳性寄生蟲,引起牛發(fā)熱、貧血、黃疸及體表淋巴結(jié)腫大等臨床癥狀。我國存在的牛泰勒蟲主要有環(huán)形泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲和中華泰勒蟲三種。牛泰勒蟲病與蜱的活動、流行密切相關(guān),因而該病呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性,呈地方性流行,很難徹底消滅;嚴(yán)重感染時甚至?xí)鹚劳?給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失和潛在威脅。本研究以核糖體r RNA的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)為靶基因,分別設(shè)計針對環(huán)形泰勒蟲、中華泰勒蟲、東方泰勒蟲的特異性引物和探針,建立了鑒別診斷三種牛泰勒蟲的實時熒光PCR方法,并對國內(nèi)部分地區(qū)的150份田間樣品進(jìn)行檢測,同時對比與建立的普通PCR方法進(jìn)行對比,對其敏感性和樣品檢出率進(jìn)行了評價。主要研究內(nèi)容如下:1.通過對18株牛泰勒蟲ITS基因序列和8條牛的巴貝斯蟲進(jìn)行序列比對和分析,發(fā)現(xiàn)牛環(huán)形泰勒蟲、中華泰勒蟲、東方泰勒蟲的各地理株之間有較高的保守性,種內(nèi)地方株之間相似性分別高達(dá)91.8%~94.2%、99.2%~97.9%、99.1%~59.2%,環(huán)形泰勒蟲與中華泰勒蟲、東方泰勒蟲的相似性分別是17%~35.6%、16.1%~35.7%,中華泰勒蟲與東方泰勒蟲的相似性40.2%~69.9%之間,而與相近的巴貝斯蟲之間變異性更高,相似性僅為15.2%~40.8%,是較理想的診斷靶標(biāo)。根據(jù)種間變異區(qū)和種內(nèi)保守區(qū),設(shè)計針對環(huán)形泰勒蟲、中華泰勒蟲、東方泰勒蟲的特異性引物和探針。設(shè)計三種牛泰勒蟲ITS基因的普通PCR引物,采用已發(fā)表的普通PCR方法,分別構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用于敏感性分析。2.成功建立了環(huán)形泰勒蟲、中華泰勒蟲、東方泰勒蟲的Taq Man探針實時熒光定量PCR方法。并對其反應(yīng)條件和體系進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果顯示這三種方法的反應(yīng)性較好,反應(yīng)曲線呈S型,有較好的擴(kuò)增效率及線性相關(guān)性;,三種牛泰勒蟲之間沒有交叉反應(yīng),且與相近牛的大巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲、卵形巴貝斯蟲、巴貝斯蟲未定種喀什株沒有交叉反應(yīng),特異性良好;可檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低濃度為100、101、101拷貝/μL,比普通PCR敏感性分別高100倍、1000倍、1000倍,敏感性較高;組內(nèi)重復(fù)性實驗變異系數(shù)Ct值均小于5%,組間變異系數(shù)均小于10%,重復(fù)性良好,3.對來自新疆、甘肅、內(nèi)蒙古三個地區(qū)的150份血液樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,環(huán)形泰勒蟲實時熒光PCR檢測及普通PCR檢測方法檢測陽性率分別為18%和8.66%;中華泰勒實時熒光PCR檢測及普通PCR檢測方法檢測陽性率分別為22.6%和10%;東方泰勒蟲實時熒光PCR檢測及普通PCR檢測方法檢測陽性率分別為43.7%和18%。進(jìn)一步對三種方法的檢測結(jié)果分析,表明其中普通PCR檢測的陽性樣品在熒光定量PCR方法檢測中也為陽性,而被熒光定量PCR檢測為陽性的某些樣品在普通PCR檢測中表現(xiàn)為陰性。證明了Taq Man探針實時熒光定量PCR鑒定牛泰勒蟲的可靠性及靈敏性。
【關(guān)鍵詞】：牛泰勒蟲 ITS 實時熒光定量PCR 檢測
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-12
• 第一章 引言12-20
• 1.1 病原學(xué)特征12-13
• 1.2 生活史13
• 1.3 流行病學(xué)13-14
• 1.4 牛泰勒蟲病診斷方法研究進(jìn)展14-18
• 1.4.1 病原學(xué)診斷14-15
• 1.4.2 血清學(xué)診斷15-16
• 1.4.3 分子生物學(xué)診斷16-18
• 1.5 研究內(nèi)容與目的18-20
• 第二章 靶基因的測序分析、引物和探針設(shè)計及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建20-31
• 2.1 材料20-21
• 2.1.1 蟲種和參考蟲種信息20-21
• 2.1.2 主要試劑21
• 2.1.3 主要儀器21
• 2.2 實驗方法21-27
• 2.2.1 牛泰勒蟲ITS基因的序列比對及同源性分析21-22
• 2.2.2 引物及探針的設(shè)計合成22-24
• 2.2.3 全血基因組提取24
• 2.2.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備24-27
• 2.3 結(jié)果與分析27-29
• 2.3.1 牛泰勒蟲ITS基因序列比對及進(jìn)化分析27-29
• 2.3.2 基因的擴(kuò)增、克隆及測序29
• 2.4 討論29-31
• 第三章 實時熒光定量PCR方法的建立及評價31-40
• 3.1 材料31
• 3.2 方法31-32
• 3.2.1 實時熒光定量PCR擴(kuò)增31-32
• 3.2.2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立32
• 3.2.3 TaqMan探針熒光定量PCR方法的評價32
• 3.3 結(jié)果與分析32-38
• 3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立32-33
• 3.3.2 特異性實驗33-34
• 3.3.3 敏感性實驗34-36
• 3.3.4 重復(fù)性實驗36-38
• 3.4 討論38-40
• 第四章 我國部分地區(qū)牛泰勒蟲熒光定量PCR檢測40-45
• 4.1 材料40
• 4.1.1 樣品來源40
• 4.1.2 主要試劑與儀器40
• 4.2 實驗方法40-41
• 4.2.1 全血基因組提取40
• 4.2.2 探針及引物的合成40-41
• 4.2.3 普通PCR檢測體系與程序41
• 4.2.4 熒光定量PCR檢測體系與程序41
• 4.3 結(jié)果41-42
• 4.3.1 牛泰勒蟲普通PCR檢測結(jié)果41-42
• 4.3.2 牛泰勒蟲實時熒光PCR檢測結(jié)果42
• 4.4 普通PCR結(jié)果和實時熒光PCR檢測結(jié)果比較42-43
• 4.5 討論43-45
• 第五章 全文結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-52
• 致謝52-53
• 作者簡歷53

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