發(fā)布時(shí)間：2017-06-28 21:20

  本文關(guān)鍵詞：三種牛泰勒蟲(chóng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：牛泰勒蟲(chóng)是寄生在牛體淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)的一種蜱傳性寄生蟲(chóng),引起牛發(fā)熱、貧血、黃疸及體表淋巴結(jié)腫大等臨床癥狀。我國(guó)存在的牛泰勒蟲(chóng)主要有環(huán)形泰勒蟲(chóng)、瑟氏泰勒蟲(chóng)和中華泰勒蟲(chóng)三種。牛泰勒蟲(chóng)病與蜱的活動(dòng)、流行密切相關(guān),因而該病呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性,呈地方性流行,很難徹底消滅;嚴(yán)重感染時(shí)甚至?xí)鹚劳?給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失和潛在威脅。本研究以核糖體r RNA的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)為靶基因,分別設(shè)計(jì)針對(duì)環(huán)形泰勒蟲(chóng)、中華泰勒蟲(chóng)、東方泰勒蟲(chóng)的特異性引物和探針,建立了鑒別診斷三種牛泰勒蟲(chóng)的實(shí)時(shí)熒光PCR方法,并對(duì)國(guó)內(nèi)部分地區(qū)的150份田間樣品進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)對(duì)比與建立的普通PCR方法進(jìn)行對(duì)比,對(duì)其敏感性和樣品檢出率進(jìn)行了評(píng)價(jià)。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.通過(guò)對(duì)18株牛泰勒蟲(chóng)ITS基因序列和8條牛的巴貝斯蟲(chóng)進(jìn)行序列比對(duì)和分析,發(fā)現(xiàn)牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)、中華泰勒蟲(chóng)、東方泰勒蟲(chóng)的各地理株之間有較高的保守性,種內(nèi)地方株之間相似性分別高達(dá)91.8%~94.2%、99.2%~97.9%、99.1%~59.2%,環(huán)形泰勒蟲(chóng)與中華泰勒蟲(chóng)、東方泰勒蟲(chóng)的相似性分別是17%~35.6%、16.1%~35.7%,中華泰勒蟲(chóng)與東方泰勒蟲(chóng)的相似性40.2%~69.9%之間,而與相近的巴貝斯蟲(chóng)之間變異性更高,相似性僅為15.2%~40.8%,是較理想的診斷靶標(biāo)。根據(jù)種間變異區(qū)和種內(nèi)保守區(qū),設(shè)計(jì)針對(duì)環(huán)形泰勒蟲(chóng)、中華泰勒蟲(chóng)、東方泰勒蟲(chóng)的特異性引物和探針。設(shè)計(jì)三種牛泰勒蟲(chóng)ITS基因的普通PCR引物,采用已發(fā)表的普通PCR方法,分別構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用于敏感性分析。2.成功建立了環(huán)形泰勒蟲(chóng)、中華泰勒蟲(chóng)、東方泰勒蟲(chóng)的Taq Man探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。并對(duì)其反應(yīng)條件和體系進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果顯示這三種方法的反應(yīng)性較好,反應(yīng)曲線呈S型,有較好的擴(kuò)增效率及線性相關(guān)性;,三種牛泰勒蟲(chóng)之間沒(méi)有交叉反應(yīng),且與相近牛的大巴貝斯蟲(chóng)、牛巴貝斯蟲(chóng)、雙芽巴貝斯蟲(chóng)、卵形巴貝斯蟲(chóng)、巴貝斯蟲(chóng)未定種喀什株沒(méi)有交叉反應(yīng),特異性良好;可檢測(cè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低濃度為100、101、101拷貝/μL,比普通PCR敏感性分別高100倍、1000倍、1000倍,敏感性較高;組內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)Ct值均小于5%,組間變異系數(shù)均小于10%,重復(fù)性良好,3.對(duì)來(lái)自新疆、甘肅、內(nèi)蒙古三個(gè)地區(qū)的150份血液樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,環(huán)形泰勒蟲(chóng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)及普通PCR檢測(cè)方法檢測(cè)陽(yáng)性率分別為18%和8.66%;中華泰勒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)及普通PCR檢測(cè)方法檢測(cè)陽(yáng)性率分別為22.6%和10%;東方泰勒蟲(chóng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)及普通PCR檢測(cè)方法檢測(cè)陽(yáng)性率分別為43.7%和18%。進(jìn)一步對(duì)三種方法的檢測(cè)結(jié)果分析,表明其中普通PCR檢測(cè)的陽(yáng)性樣品在熒光定量PCR方法檢測(cè)中也為陽(yáng)性,而被熒光定量PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的某些樣品在普通PCR檢測(cè)中表現(xiàn)為陰性。證明了Taq Man探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定牛泰勒蟲(chóng)的可靠性及靈敏性。
【關(guān)鍵詞】：牛泰勒蟲(chóng) ITS 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.7
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-12
• 第一章 引言12-20
• 1.1 病原學(xué)特征12-13
• 1.2 生活史13
• 1.3 流行病學(xué)13-14
• 1.4 牛泰勒蟲(chóng)病診斷方法研究進(jìn)展14-18
• 1.4.1 病原學(xué)診斷14-15
• 1.4.2 血清學(xué)診斷15-16
• 1.4.3 分子生物學(xué)診斷16-18
• 1.5 研究?jī)?nèi)容與目的18-20
• 第二章 靶基因的測(cè)序分析、引物和探針設(shè)計(jì)及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建20-31
• 2.1 材料20-21
• 2.1.1 蟲(chóng)種和參考蟲(chóng)種信息20-21
• 2.1.2 主要試劑21
• 2.1.3 主要儀器21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-27
• 2.2.1 牛泰勒蟲(chóng)ITS基因的序列比對(duì)及同源性分析21-22
• 2.2.2 引物及探針的設(shè)計(jì)合成22-24
• 2.2.3 全血基因組提取24
• 2.2.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備24-27
• 2.3 結(jié)果與分析27-29
• 2.3.1 牛泰勒蟲(chóng)ITS基因序列比對(duì)及進(jìn)化分析27-29
• 2.3.2 基因的擴(kuò)增、克隆及測(cè)序29
• 2.4 討論29-31
• 第三章 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立及評(píng)價(jià)31-40
• 3.1 材料31
• 3.2 方法31-32
• 3.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增31-32
• 3.2.2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立32
• 3.2.3 TaqMan探針熒光定量PCR方法的評(píng)價(jià)32
• 3.3 結(jié)果與分析32-38
• 3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立32-33
• 3.3.2 特異性實(shí)驗(yàn)33-34
• 3.3.3 敏感性實(shí)驗(yàn)34-36
• 3.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)36-38
• 3.4 討論38-40
• 第四章 我國(guó)部分地區(qū)牛泰勒蟲(chóng)熒光定量PCR檢測(cè)40-45
• 4.1 材料40
• 4.1.1 樣品來(lái)源40
• 4.1.2 主要試劑與儀器40
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法40-41
• 4.2.1 全血基因組提取40
• 4.2.2 探針及引物的合成40-41
• 4.2.3 普通PCR檢測(cè)體系與程序41
• 4.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)體系與程序41
• 4.3 結(jié)果41-42
• 4.3.1 牛泰勒蟲(chóng)普通PCR檢測(cè)結(jié)果41-42
• 4.3.2 牛泰勒蟲(chóng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果42
• 4.4 普通PCR結(jié)果和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果比較42-43
• 4.5 討論43-45
• 第五章 全文結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-52
• 致謝52-53
• 作者簡(jiǎn)歷53

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2 陳旭;齊鳳坤;康立功;李景富;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2010年08期

3 孫傲雪;徐鳳花;劉洋;郭慧娟;曹艷花;張曉霞;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR在固氮酶基因檢測(cè)中的應(yīng)用[J];生物技術(shù)通報(bào);2011年03期

4 黃海泉;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在植物檢疫中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年01期

5 衡靜;梁芳芳;于曉瑩;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其在植物中的應(yīng)用[J];河南農(nóng)業(yè);2013年16期

6 劉麗;何望;周忠義;李琦華;賈俊靜;余紅心;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在水產(chǎn)研究中的應(yīng)用[J];江西飼料;2009年02期

7 薛霜;獨(dú)軍政;高閃電;�；菔|;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究進(jìn)展及其在獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J];中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào);2010年07期

8 徐楠楠;胡桂學(xué);;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2011年21期

9 許安君;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在糧油轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中的應(yīng)用[J];糧油食品科技;2013年02期

10 張賀;李波;周虛;譚建華;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究進(jìn)展及應(yīng)用[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2006年S1期

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1 回文廣;趙廷昌;孫福在;張卉;王建榮;高孝強(qiáng);田麗;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理及其應(yīng)用[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)第六屆青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集——植物病理學(xué)研究進(jìn)展（第五卷）[C];2003年

2 歐華;卞美璐;張小燕;陳慶云;李敏;劉軍;陳穎;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在人乳頭狀瘤病毒檢測(cè)中的應(yīng)用研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第九次全國(guó)婦科腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

3 喬昀;趙英妹;仲俊;張玨;龔捷文;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR在快速檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中的評(píng)價(jià)與應(yīng)用[A];第一次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)成立大會(huì)論文匯編[C];2014年

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5 許小紅;劉在新;包慧芳;王雯慧;牛繼偉;;實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)及其存在的問(wèn)題和優(yōu)化方案[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2006學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（上冊(cè)）[C];2006年

6 李翊衛(wèi);王惠軍;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)胸水端粒酶活性[A];2006年浙江省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2006年

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8 盧亦愚;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其在病毒性疾病應(yīng)急診斷中的應(yīng)用[A];應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件論壇論文集[C];2005年

9 彭年才;李春彬;李紅東;李煒;龔大江;張鎮(zhèn)西;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的研制[A];中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程進(jìn)展——2007中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程聯(lián)合學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2007年

10 吉永;胡大春;趙曉麗;邵劍春;劉德華;;雙色實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)臨床常見(jiàn)細(xì)菌方法建立[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)分會(huì)成立30周年慶典大會(huì)資料匯編[C];2009年

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1 記者 張平陽(yáng) 楊斌鵠;快速檢測(cè)甲流 西安批量生產(chǎn)關(guān)鍵設(shè)備[N];西安日?qǐng)?bào);2009年

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1 秦子禹;蘋(píng)果內(nèi)參基因的篩選及三種潛隱性病毒TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 王好;鯉皰疹病毒3型實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立及囊膜蛋白108的表達(dá)免疫研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

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1 湯虹;生物質(zhì)降解嗜熱厭氧菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用[D];華南理工大學(xué);2015年

2 許京鋒;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)內(nèi)、外源IGF-Ⅰ表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2015年

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9 龐方圓;羊痘病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

10 吉永;雙色實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)臨床常見(jiàn)細(xì)菌方法的建立[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2009年

  本文關(guān)鍵詞：三種牛泰勒蟲(chóng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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