本文關(guān)鍵詞：腸炎沙門菌sipA缺失株的構(gòu)建及SipA蛋白促炎效應(yīng)初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腸炎沙門菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis, SE)是革蘭陰性、兼性胞內(nèi)寄生菌,主要寄生在人和動物的腸道,可引起胃腸炎甚至嚴(yán)重的全身性感染,是重要的人獸共患病病原菌。由SPI-1和SPI-2編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)是沙門菌致病重要的毒力因子之一,T3SS的效應(yīng)蛋白在細(xì)菌致病過程中發(fā)揮多重功能。目前針對這些效應(yīng)蛋白的研究主要以鼠傷寒沙門菌為模型,在腸炎沙門菌中的功能研究鮮有報道。鼠傷寒沙門菌SipA是由與侵襲相關(guān)的T3SS-1分泌至宿主細(xì)胞的效應(yīng)蛋白。SipA蛋白通過羧基端調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動蛋白骨架結(jié)構(gòu)促進(jìn)沙門菌侵襲腸上皮細(xì)胞,通過氨基端激活腸上皮細(xì)胞的信號通路,引起腸道的炎癥。本研究采用λ-Red同源重組技術(shù)構(gòu)建腸炎沙門菌sipA基因缺失株,探討了sipA與腸炎沙門菌致病性的關(guān)系,為進(jìn)一步研究腸炎沙門氏菌感染過程中sipA基因的功能奠定基礎(chǔ)。1腸炎沙門菌SipA蛋白的原核表達(dá)及腸炎沙門菌C50336△sipA缺失株的構(gòu)建與鑒定本研究利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)-sipA,并將其導(dǎo)入大腸桿菌E.coli BL21(DE3),通過IPTG的誘導(dǎo),表達(dá)了腸炎沙門菌C50336的效應(yīng)蛋白SipA。SDS-PAGE結(jié)果顯示,重組蛋白SipA以可溶性的形式表達(dá),并且蛋白大小與預(yù)期一致。將純化的SipA蛋白免疫BALB/c小鼠后制備其多抗血清。利用λ-Red同源重組系統(tǒng)對腸炎沙門菌sipA基因進(jìn)行了敲除,成功構(gòu)建腸炎沙門菌C50336的sipA基因缺失株。將sipA基因克隆至回復(fù)質(zhì)粒pBR322后電轉(zhuǎn)化缺失株中,構(gòu)建回復(fù)株C50336△sipApsipA。用制備的多抗血清作一抗,Western blot檢測SipA蛋白體外表達(dá)情況,結(jié)果顯示SipA蛋白能在體外培養(yǎng)條件下表達(dá)。比較野生株C50336、缺失株C50336△sipA及回復(fù)株C50336△sipApsipA的基本生物學(xué)特性及毒力。結(jié)果顯示：sipA基因的缺失不影響C50336的生長特性、生化特性以及毒力,且缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。腸炎沙門菌sipA基因缺失株的成功構(gòu)建為后期研究sipA基因在腸炎沙門菌致病過程中發(fā)揮的作用提供了相應(yīng)的生物材料。2腸炎沙門菌SipA蛋白促炎效應(yīng)的初步研究對腸炎沙門菌野生株C50336、缺失株C50336△sipA及回復(fù)株C50336△sipApsipA進(jìn)行Caco-2細(xì)胞黏附和侵襲實驗。結(jié)果表明sipA基因缺失不影響腸炎沙門菌的黏附能力,但引起細(xì)菌侵襲能力降低。分別將野生株、缺失株及回復(fù)株侵襲Caco-2 BBE細(xì)胞0.5 h,Western blot及激光共聚焦顯微鏡鑒定細(xì)胞凋亡蛋白Bax的表達(dá)情況,并測定細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示,sipA基因缺失株引起細(xì)胞的促凋亡蛋白Bax表達(dá)下調(diào),且細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例顯著降低。構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1flag-sipA并瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,經(jīng)間接免疫熒光鑒定,SipA在HEK293T細(xì)胞得到表達(dá)。將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1flag-sipA分別瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T, HeLa細(xì)胞后利用熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活活性。將野生株、缺失株及回復(fù)株感染已轉(zhuǎn)染熒光素酶報告載體(pGL4.32)的HeLa細(xì)胞,熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活活性。結(jié)果顯示,真核表達(dá)pcDN A3.1flag-sipA瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T、HeLa細(xì)胞后,與空載體轉(zhuǎn)染結(jié)果相比,兩種細(xì)胞的NF-κB活性顯著上調(diào)。與野生株和回復(fù)株相比,sipA基因缺失株引起HeLa的NF-κB活化程度顯著降低。從蛋白和細(xì)菌兩個水平說明SipA能夠活化NF-κB信號通路。將野生株、缺失株、回復(fù)株口服感染鏈霉素處理的C57BL/6小鼠進(jìn)行組織切片的觀察以及血清中細(xì)胞因子的測定。組織切片結(jié)果顯示,缺失株感染組肝臟、結(jié)腸、盲腸的病理變化程度輕于野生株和回復(fù)株感染組。與野生株和回復(fù)株相比,缺失株感染組血清中IL-6、MCP-1、TNF-α和IFN-y顯著降低,說明SipA蛋白為腸炎沙門菌的促炎性效應(yīng)蛋白,可促使宿主腸道炎癥的產(chǎn)生。本研究初步闡明sipA基因在腸炎沙門菌引發(fā)宿主炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮作用。
【關(guān)鍵詞】：腸炎沙門菌 sipA基因 同源重組 侵襲 凋亡 炎癥 NF-κB
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-8
• 符號說明8-9
• 綜述 沙門菌毒力島編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)、效應(yīng)蛋白功能的研究進(jìn)展9-20
• 1 沙門菌毒力島及Ⅲ型分泌系統(tǒng)9-10
• 2 效應(yīng)蛋白介導(dǎo)沙門菌對腸上皮細(xì)胞的侵襲10-11
• 3 沙門菌效應(yīng)蛋白參與的炎癥相關(guān)信號通路11-13
• 4 結(jié)語13
• 參考文獻(xiàn)13-20
• 第一章 腸炎沙門菌SipA蛋白表達(dá)及sip A基因缺失株的構(gòu)建與基本生物學(xué)鑒定20-38
• 1 材料20-22
• 2 方法22-29
• 3 結(jié)果29-35
• 4 討論35-36
• 參考文獻(xiàn)36-38
• 第二章 腸炎沙門菌SipA蛋白促炎效應(yīng)的初步研究38-57
• 1 材料38-39
• 2 方法39-46
• 3 結(jié)果46-54
• 4 討論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-57
• 致謝57-58
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文58-59

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本文編號：475205