本文關(guān)鍵詞：奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌多價(jià)毒力因子疫苗的構(gòu)建及臨床試驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人們對于奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌疫苗的研究已經(jīng)進(jìn)行了幾十年的時(shí)間了,但針對金黃色葡萄球菌單一的毒力因子的活苗,滅活苗以及基因工程疫苗均未取得顯著的免疫效果。本實(shí)驗(yàn)的主要目的是先通過分離牛外周血的淋巴細(xì)胞克隆得到牛IgG-Fc基因片段,再采用重疊延伸PCR的方法將IgG-Fc基因與本實(shí)驗(yàn)室制備好的重組FnBPB-ClfA基因進(jìn)行串聯(lián),構(gòu)建了串聯(lián)基因牛Fc-FnBPB-ClfA。將Fc-FnBPB-ClfA克隆到原核表達(dá)載體pET32a(+)中,進(jìn)行目的蛋白的可溶性誘導(dǎo)表達(dá)。最后配合鋁鹽佐劑對10頭經(jīng)CMT檢測患有隱性乳房炎的奶牛進(jìn)行兩次免疫。首次免疫選擇在奶牛干奶前14天進(jìn)行肌肉注射免疫,第二次免疫在奶牛干奶的同時(shí)進(jìn)行乳頭管注射免疫。免疫分離得到的血清用間接ELISA法檢測10頭牛的的抗體水平。結(jié)果表明,免疫效果良好。在奶牛產(chǎn)犢后開始正常擠奶時(shí)再對其進(jìn)行體細(xì)胞數(shù)的測定,結(jié)果顯示10頭免疫組牛乳樣中的體細(xì)胞數(shù)均在每毫升10萬,證明疫苗的免疫效果良好。本實(shí)驗(yàn)通過對感染隱性乳房炎的奶牛免疫獲得了良好的免疫效果,為今后奶牛乳房炎疫苗的研究提供了可靠的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：金黃色葡萄球菌 免疫 奶牛乳房炎
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.23
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 縮略語表9-10
• 1 前言10-17
• 1.1 病原微生物10
• 1.2 金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性10-11
• 1.3 金黃色葡萄球菌的毒力因子11-12
• 1.4 金黃色葡萄球菌粘附素的研究概況12-13
• 1.4.1 凝集因子12
• 1.4.2 纖連素結(jié)合蛋白12-13
• 1.5 奶牛乳腺的免疫防御屏障13
• 1.6 FcRn研究進(jìn)展13-14
• 1.6.1 牛乳中免疫球蛋白13-14
• 1.6.2 FcRn研究進(jìn)展14
• 1.6.3 FcRn的分子結(jié)構(gòu)14
• 1.7 金黃色葡萄球菌疫苗研究進(jìn)展14-16
• 1.7.1 全菌滅活疫苗15
• 1.7.2 弱毒活苗15
• 1.7.3 亞單位疫苗15
• 1.7.4 核酸疫苗15-16
• 1.7.5 抗原抗體復(fù)合物疫苗16
• 1.8 本研究的目的及意義16-17
• 2 研究一 Fc-FnBPB-ClfA的基因串聯(lián)17-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料17-19
• 2.1.1 主要儀器17
• 2.1.2 載體與試劑17-18
• 2.1.3 質(zhì)粒及血樣18
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)所需主要溶液18
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)流程圖18-19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-26
• 2.2.1 泌乳奶牛血中分離淋巴細(xì)胞19-20
• 2.2.2 牛淋巴細(xì)胞中總RNA的提取20
• 2.2.3 反轉(zhuǎn)錄20-22
• 2.2.4 牛Fc基因片段回收及純化22-23
• 2.2.5 重組質(zhì)粒pMD19T-Fc的構(gòu)建23
• 2.2.6 重組質(zhì)粒pMD19T-Fc的PCR鑒定23-24
• 2.2.7 提取重組質(zhì)粒pMD19T-Fc24-25
• 2.2.8 重組質(zhì)粒pMD19T-Fc測序25
• 2.2.9 Fc基因與FnBPB-ClfA基因的串聯(lián)25-26
• 2.2.10 重組質(zhì)粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA的構(gòu)建26
• 2.2.11 重組質(zhì)粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA的PCR鑒定26
• 2.2.12 重組質(zhì)粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA的提取26
• 2.2.13 重組質(zhì)粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA序列測定26
• 2.3 結(jié)果26-29
• 2.3.1 牛外周血淋巴細(xì)胞總RNA完整性鑒定26-27
• 2.3.2 IgG Fc基因片段的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果27-28
• 2.3.3 重組質(zhì)粒pMD19T-Fc序列的測定結(jié)果及分析28
• 2.3.4 Fc-FnBPB-ClfA串聯(lián)基因PCR擴(kuò)增結(jié)果28-29
• 2.4 討論29
• 2.5 小結(jié)29-30
• 3 研究二 融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA的原核表達(dá)30-45
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料30-34
• 3.1.1 表達(dá)載體30-31
• 3.1.2 主要試劑31
• 3.1.3 主要儀器31-32
• 3.1.4 主要溶液的配制32-33
• 3.1.5 試驗(yàn)流程圖33-34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法34-37
• 3.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Fc-FnBPB-ClfA的構(gòu)建34-35
• 3.2.2 重組蛋白Fc-FnBPB-ClfA的誘導(dǎo)表達(dá)及分析35-37
• 3.3 結(jié)果37-44
• 3.3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定37-38
• 3.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Fc-FnBPPB-ClfA序列的測定結(jié)果及分析38-41
• 3.3.3 重組蛋白最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定41
• 3.3.4 重組蛋白最佳誘導(dǎo)劑濃度確定41-42
• 3.3.5 重組蛋白的可溶性鑒定42-43
• 3.3.6 重組目的蛋白的純化43
• 3.3.7 重組蛋白濃度測定結(jié)果43-44
• 3.4 討論44
• 3.4.1 表達(dá)系統(tǒng)的選擇44
• 3.5 小結(jié)44-45
• 4 研究三 重組蛋白Fc-FnBPB-ClfA配合鋁鹽佐劑對本動物免疫學(xué)的研究45-53
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料45
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)動物45
• 4.1.2 重組蛋白與試劑45
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法45-53
• 4.2.1 制備鋁鹽佐劑與重組蛋白Fc-FnBPB-ClfA的混合疫苗45
• 4.2.2 奶牛的免疫程序45
• 4.2.3 牛乳中體細(xì)胞數(shù)的測定45-46
• 4.2.4 牛乳中體細(xì)胞數(shù)的測定的結(jié)果46
• 4.2.5 牛血清中Fc-FnBPB-ClfA抗體的測定46
• 4.2.6 免疫奶牛血清ELISA抗體水平檢測結(jié)果46-53
• 5 總體討論與結(jié)論53-55
• 5.1 總體討論53
• 5.2 總體結(jié)論53-55
• 致謝55-56
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 作者簡介60

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7 馬

本文編號：471481