本文關鍵詞：豬肺泡巨噬細胞M1亞型及豬KLF4基因?qū)RRSV復制影響的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是最早于1987年在美國首次被發(fā)現(xiàn)的一種新型病毒性傳染病,是現(xiàn)今世界上危害養(yǎng)豬業(yè)最重要的疾病之一。巨噬細胞是一種分布廣泛的免疫細胞,可以根據(jù)內(nèi)環(huán)境的變化從而極化為不同的類型：經(jīng)典活化巨噬細胞(M1),以及替代活化巨噬細胞(M2)。豬肺泡巨噬細胞(Porcine alveolar macrophage, PAMs)是PRRSV感染后豬只體內(nèi)最重要的靶細胞。所以本實驗首先通過建立PAMs體外極化模型,研究PAMs極化對PRRSV感染的影響以及PRRSV感染對PAMs影響的動態(tài)學變化。實驗采用預冷法分離：PAMs,并在體外進行培養(yǎng),分別用LPS/IFN-γ誘導刺激M1型巨噬細胞；用IL-4誘導刺激分化為M2型巨噬細胞。通過半定量PCR分別檢測M1,M2型Marker (M1:IL-1β,IL-12,IL-23和CXCL10; M2: Arg-1, IL-10, PPARy和YM-1)表達量的變化,從核酸水平上證明極化模型的成功。同時用Western blotting從蛋白水平上確定M1型,M2型PAMs的極化成功。之后用500TCID50 HuN4-F5株PRRSV感染極化后的PAMs亞型,在感染后的12,24,36和48h分別通過間IFA和Western blotting對PRRSV的感染量進行測定。結果發(fā)現(xiàn)在感染后的12至36h內(nèi)M1型PAMs中PRRSV的感染量明顯低于正常組和M2型PAMs的感染量,而在感染后的48h時M1組中PRRSV的感染量與正常組和M2型PAMs中的感染量基本一致,無顯著性的差異。然而PAMs主要通過其表面的模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)發(fā)揮其天然免疫防御的功能。那么是否PRRSV感染M1型巨噬細胞對其模式識別受體產(chǎn)生了影響,從而M1型巨噬細胞對PRRSV感染在一段時間內(nèi)產(chǎn)生了抑制。因此我們通過熒光定量PCR的方法對感染PRRSV的M1型巨噬細胞模式識別受體mRNA的表達量進行了測定,并同時對被認為是巨噬細胞極化的關鍵調(diào)節(jié)因子的KLF4基因也進行了測定。而在測定結果中我們意外的發(fā)現(xiàn)PRRSV感染極化后M1型巨噬細胞中的KLF4表達量與M1型巨噬細胞對PRRSV復制的影響趨勢相似。結果表明感染PRRSV后,隨著時間的變化M1型巨噬細胞中KLF4的表達量逐漸降低,在12h達到最低,24h后KLF4的表達量逐漸升高,且在感染后48h時KLF4的表達量與正常組的表達量基本一致,無顯著性差異。因此為了進一步研究豬KLF4基因?qū)RRSV復制的影響,本實驗通過PCR技術擴增得到豬KLF4基因,通過TA克隆構建pMD18-T-KLF4重組質(zhì)粒。酶切鑒定后將KLF4的cDNA亞克隆至pCMV-HA載體,構建重組質(zhì)粒pCMV-HA-KLF4。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCMV-HA-KLF4在Marc-145中,12h后感染PRRSV,并在感染后24h通過Western blotting對PRRSV的感染量進行進行測定。結果表明KLF4基因?qū)RRSV的感染有一定的促進作用。
【關鍵詞】：PRRSV 巨噬細胞極化 模式識別受體 KLF4 真核表達
【學位授予單位】：延邊大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 前言13-24
• 1 豬繁殖與呼吸綜合征概述13-17
• 1.1 豬繁殖與呼吸綜合征概述13
• 1.2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒13-17
• 2 巨噬細胞概述17-22
• 2.1 天然免疫17-18
• 2.2 巨噬細胞18
• 2.3 單核-巨噬細胞系統(tǒng)18-19
• 2.4 巨噬細胞極化19-21
• 2.5 巨噬細胞極化與疾病的相關性21-22
• 3 KLF4及其與病毒感染22-23
• 4 研究目的和意義23-24
• 材料與方法24-36
• 1 材料24-25
• 1.1 試驗動物24
• 1.2 試驗細胞24
• 1.3 試驗病毒24
• 1.4 試驗主要試劑24-25
• 2 方法25-36
• 2.1 PAMs的分離培養(yǎng)25
• 2.2 間接免疫熒光鑒定PAMs的純度25-26
• 2.3 PAMs體外極化刺激處理26
• 2.4 半定量PCR測定極化相關因子mRNA表達水26-28
• 2.5 Western blot檢測極化標記分子蛋白表達水平28-29
• 2.6 iNOS活性的測29-30
• 2.7 Arg-1活性的測定30
• 2.8 PRRSV TCID50的測定30-31
• 2.9 PRRSV感染PAMs極化亞型細胞31
• 2.10 熒光定量PCR31-32
• 2.11 豬KLF4基因的PCR擴增32-33
• 2.12 PCR產(chǎn)物的純化回收33
• 2.13 目的基因KLF4與pMD-18T simple載體重組連接33
• 2.14 重組連接后質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化33-34
• 2.15 重組克隆的篩選34
• 2.16 搖菌34
• 2.17 提取重組克隆質(zhì)粒34-35
• 2.18 pCMV-HA真核表達質(zhì)粒的構建35
• 2.19 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒PCMV-HA-KLF4在Marc-145細胞中的表達及其對PRRSV復制影P向的初步探索35
• 2.20 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析35-36
• 結果36-47
• 1 豬肺泡巨噬細胞(PAMs)純度的鑒定36
• 2 豬肺泡巨噬細胞(PAMs)體外極化模型的建立36-39
• 2.1 半定量PCR鑒定巨噬細胞的極化狀態(tài)36-37
• 2.2 iNOS和Arginase-1酶活性的測定37-38
• 2.3 IL-12和Arg-1蛋白含量的檢測38-39
• 3 PAMs極化的亞型對PPRSV增殖的影39-40
• 3.1 PRRSV N蛋白間接免疫熒光的觀察39
• 3.2 N蛋白的定量分析39-40
• 4 PRRSV感染M1型巨噬細胞對其模式識別受體mRNA表達的影響40-42
• 4.1 感染PRRSV后M1型巨噬細胞模式識別受體mRNA表達40-41
• 4.2 感染PRRSV后M1型巨噬細胞KLF4表達41-42
• 5 豬KLF4基因真核表達載體構建42-46
• 5.1 PCR擴增結果42
• 5.2 重組質(zhì)粒pMD-18T-KLF4質(zhì)粒的篩選及鑒定42-43
• 5.3 重組質(zhì)粒pMD-18T-KLF4的測序分析43-45
• 5.4 重組質(zhì)粒pCMV-HA-KLF4的酶切鑒定45-46
• 6 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCMV-HA-KLF4在Marc-145細胞中的表達及其對PRRSV復制影響的初步探索46-47
• 討論47-50
• 結論50-51
• 參考文獻51-57
• 致謝57-58
• 作者簡介58-59
• 附錄59

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本文編號：467759