本文關(guān)鍵詞：鑒別PRRS野毒株與TJM-F92疫苗株間接ELISA方法的建立與初步應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是引起母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀并造成免疫抑制的病毒性傳染病,尤其是在2006年高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS)大范圍爆發(fā)和流行,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失。目前我國主要依靠接種疫苗和執(zhí)行嚴(yán)格生物安全措施進(jìn)行PRRS的防控,而中長期防治PRRS需進(jìn)一步的凈化豬群。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒TJM-F92疫苗株(HP-PRRSV TJM-F92)是HP-PRRSV TJ株在細(xì)胞上連續(xù)傳代至92代所得弱毒疫苗株。TJM-F92的非結(jié)構(gòu)蛋白2(non-structural protein2,Nsp2)存在一段連續(xù)的120個氨基酸缺失。本研究利用表達(dá)TJM-F92疫苗株Nsp2蛋白上連續(xù)缺失的120個氨基酸的原核表達(dá)質(zhì)粒GST-Nsp2-d120表達(dá)蛋白GST-d120,并將純化的GST-d120蛋白作為包被抗原,建立并優(yōu)化了鑒別診斷PRRSV野毒感染和弱毒活疫苗TJM-F92免疫動物的間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法,命名為d120-ELISA。建立d120-ELISA后,采用受試者工作曲線方法對270份血清的OD值進(jìn)行分析,確定d120-ELISA的陰陽性臨界S/P值為0.25。當(dāng)S/P值為0.25時,d120-ELISA的敏感性為90.7%,特異性為95.1%;d120-ELISA檢測其他常見豬病陽性血清的結(jié)果表明其具有PRRS特異性;重復(fù)性試驗結(jié)果顯示變異系數(shù)在0.77~17.02%;以上結(jié)果表明d120-ELISA具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性。與商品化試劑盒對比結(jié)果顯示,檢測野毒感染或其他弱毒活疫苗免疫陽性血清的符合率為90.7%,檢測PRRSV陰性血清的符合率為92.2%,商品化試劑盒檢測為陽性的TJM-F92或滅活疫苗免疫血清,d120-ELISA檢測全為陰性,表明d120-ELISA能夠區(qū)分PRRSV野毒感染與弱毒活疫苗TJM-F92免疫動物。為進(jìn)一步驗證鑒別d120-ELISA方法能夠區(qū)分野毒感染與弱毒活疫苗TJM-F92免疫動物,本研究通過采集10頭試驗動物210份血清進(jìn)行血清動力學(xué)試驗,同時采集具有明確免疫背景的150份臨床血清進(jìn)行鑒別d120-ELISA方法的臨床初步應(yīng)用。血清動力學(xué)試驗和臨床血清檢測結(jié)果均表明d120-ELISA檢測陽性抗體時間晚于IDEXX 10 d左右,但d10-ELISA方法可以鑒別出IDEXX試劑盒無法鑒別的免疫弱毒活疫苗TJM-F92或免疫滅活疫苗豬群中發(fā)生野毒感染的動物。綜上所述,本實驗建立了具有良好敏感性、特異性和重復(fù)性的鑒別PRRSV野毒感染和弱毒活疫苗TJM-F92免疫動物的d120-ELISA方法,檢測試驗動物血清和臨床血清結(jié)果表明d120-ELISA方法可以區(qū)分野毒感染和弱毒活疫苗TJM-F92免疫的動物。本研究為組裝d120-ELISA試劑盒,鑒別弱毒活疫苗TJM-F92免疫豬群中野毒感染陽性動物,促進(jìn)豬場的凈化奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬繁殖與呼吸綜合征 TJM-F92 Nsp2 間接ELISA 鑒別野毒感染與疫苗接種
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 引言13-20
• 1.1 病原學(xué)與流行病學(xué)13-14
• 1.1.1 PRRSV的病原學(xué)13-14
• 1.1.2 流行病學(xué)14
• 1.2 PRRSV主要非結(jié)構(gòu)蛋白的功能14-16
• 1.3 PRRSV實驗室檢測方法研究進(jìn)展16-17
• 1.4 PRRS的綜合防控17-19
• 1.4.1 影響PRRSV傳播的主要因素17-18
• 1.4.2 PRRS的防控18-19
• 1.5 本研究的目的及意義19-20
• 第二章 弱毒疫苗株TJM-F92 Nsp2缺失120個氨基酸重組蛋白的表達(dá)20-25
• 2.1 實驗材料20
• 2.1.1 質(zhì)粒和血清20
• 2.1.2 主要試劑和儀器20
• 2.2 方法20-22
• 2.2.1 GST-d120蛋白的表達(dá)20-21
• 2.2.2 GST-d120蛋白的純化21
• 2.2.3 SDS-PAGE與Western blot鑒定純化蛋白21-22
• 2.2.4 純化蛋白濃度的測定22
• 2.3 結(jié)果與分析22-23
• 2.3.1 純化GST-d120蛋白的SDS-PAGE與Western blot分析鑒定22-23
• 2.3.2 純化蛋白濃度測定結(jié)果23
• 2.4 討論23-25
• 第三章 鑒別PRRSV野毒感染和疫苗免疫間接ELISA方法的建立25-41
• 3.1 材料25
• 3.1.1 血清樣品25
• 3.1.2 主要試劑和儀器25
• 3.2 方法25-29
• 3.2.1 方陣法確定蛋白最佳包被濃度及血清稀釋度25-26
• 3.2.2 最佳抗原包被液和包被條件的優(yōu)化26
• 3.2.3 最佳封閉液和封閉條件的優(yōu)化26
• 3.2.4 最佳血清稀釋液和作用時間的優(yōu)化26-27
• 3.2.5 最佳酶標(biāo)二抗稀釋液、工作濃度和作用時間的優(yōu)化27
• 3.2.6 最佳TMB作用時間的優(yōu)化27
• 3.2.7 d120-ELISA方法臨界值的確定27-28
• 3.2.8 d120-ELISA特異性試驗28
• 3.2.9 d120-ELISA方法的敏感性28
• 3.2.10 d120-ELISA重復(fù)性試驗28
• 3.2.11 與IDEXX PRRSV X3試劑盒的對比性分析28-29
• 3.3 結(jié)果與分析29-39
• 3.3.1 蛋白最佳包被濃度及血清稀釋度的確定29-30
• 3.3.2 最佳抗原包被液和包被條件的確定30-31
• 3.3.3 最佳封閉液和封閉條件的確定31-32
• 3.3.4 最佳血清稀釋液和作用時間的確定32-33
• 3.3.5 最佳酶標(biāo)二抗稀釋液、工作濃度和作用時間的確定33-35
• 3.3.6 最佳TMB作用時間的確定35
• 3.3.7 d120-ELISA方法最終反應(yīng)條件的確定35
• 3.3.8 d120-ELISA方法臨界值的確定35-36
• 3.3.9 d120-ELISA特異性分析36-37
• 3.3.10 d120-ELISA的敏感性試驗37
• 3.3.11 d120-ELISA的重復(fù)性結(jié)果37-39
• 3.3.12 與IDEXX PRRSV X3試劑盒的對比性結(jié)果39
• 3.4 討論39-41
• 第四章 血清動力學(xué)實驗和鑒別d120-ELISA的臨床應(yīng)用41-48
• 4.1 材料和方法41-43
• 4.1.1 主要試劑及儀器41
• 4.1.2 GST-d120血清動力學(xué)試驗41-42
• 4.1.3 臨床血清采集試驗設(shè)計42
• 4.1.4 樣品OD值檢測與陰陽性的判定42-43
• 4.2 結(jié)果與分析43-46
• 4.2.1 GST-d120蛋白血清動力學(xué)試驗結(jié)果與分析43-44
• 4.2.2 臨床血清檢測結(jié)果與分析44-46
• 4.3 討論46-48
• 第五章 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-56
• 附錄56-61
• 致謝61-62
• 作者簡介62

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳玉石;肖運(yùn)才;胡思順;李自力;石德時;畢丁仁;;禽流感疫苗免疫和野毒感染的鑒別診斷策略[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2007年02期

2 孔祥峰;Bartvan Leerdam;Pieter Kuhne;;IBV野毒感染的診斷[J];國外畜牧學(xué)(豬與禽);2010年01期

3 賀靜;;新城疫野毒感染蛋雞的臨床癥狀與防治[J];養(yǎng)殖技術(shù)顧問;2013年10期

4 林振營;周平;王天芳;羅才慶;丘壽勝;張華全;;某豬場種豬群偽狂犬病野毒感染狀況及其對生產(chǎn)成績的影響[J];福建畜牧獸醫(yī);2009年01期

5 曾強(qiáng);陳響坤;白挨泉;黃良宗;顧萬軍;;利用gE-ELISA技術(shù)對廣東部分豬場豬偽狂犬病野毒感染的檢測[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年08期

6 ;豬場存在豬群抗體檢測水平監(jiān)測過多的誤區(qū)[J];畜禽業(yè);2014年01期

7 蔣紅;龔建軍;尹晨輝;;規(guī)模豬場成年公豬偽狂犬野毒感染抗體(gPI抗體)的檢測結(jié)果初報[J];湖南畜牧獸醫(yī);2011年02期

8 劉志杰;任慧英;溫建新;劉文華;鄒玲;韓先杰;魏笑笑;;用地高辛標(biāo)記的核酸探針檢測豬偽狂犬病毒野毒感染的研究[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;2008年11期

9 周斌,蘇鑫銘,張素芳,賈峗,曹瑞兵,陳溥言;PCR快速檢測偽狂犬病病毒野毒感染[J];中國病毒學(xué);2004年06期

10 常洪濤;劉慧敏;郭占達(dá);杜季梅;趙軍;陳陸;楊霞;王新衛(wèi);姚惠霞;王川慶;;河南省及周邊省份豬群中大面積感染豬偽狂犬病毒的病因分析[J];病毒學(xué)報;2014年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 劉志杰;任慧英;溫建新;劉文華;鄒玲;韓先杰;;地高辛標(biāo)記的核酸探針檢測豬偽狂犬病毒野毒感染的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第三屆豬病防控學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

2 王澤霖;李建麗;陳少渠;馬仲彬;;非結(jié)構(gòu)蛋白NS_1-ELISA檢測禽流感野毒感染抗體[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第六屆全國會員代表大會暨第11次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2005年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 山東省農(nóng)科院 王成立 研究員;洞察動物健康水平的“秘密武器”[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2006年

2 山東省農(nóng)科院 王成立 研究員;淘汰劣質(zhì)豬是利大？弊大？[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2006年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王寅彪;豬偽狂犬病野毒感染與疫苗免疫鑒別診斷方法的建立及初步臨床應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2015年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 劉楊;鑒別鹿結(jié)核病野毒感染與卡介苗免疫間接ELISA方法的建立及初步驗證[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 王西西;鑒別PRRS野毒株與TJM-F92疫苗株間接ELISA方法的建立與初步應(yīng)用[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

3 王仰杰;廣西豬PRV分子病原學(xué)調(diào)查及快速鑒別野毒感染雙功能性分子的構(gòu)建[D];廣西大學(xué);2008年

4 彭小華;豬胸膜肺炎放線桿菌快速檢測技術(shù)的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

  本文關(guān)鍵詞：鑒別PRRS野毒株與TJM-F92疫苗株間接ELISA方法的建立與初步應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：458791