發(fā)布時(shí)間：2017-06-14 21:12

  本文關(guān)鍵詞：重組銅綠假單胞桿菌延長(zhǎng)因子Tu與脂蛋白（a）的相互作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：銅綠假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa)表面的翻譯延長(zhǎng)因子Tu (Elongation factor Tu, Tu)可與人纖溶酶原(Plasminogen, Plg)特異性結(jié)合,這種結(jié)合態(tài)的Pig被激活后可降解宿主胞外基質(zhì),有利于致病菌穿越組織屏障。本實(shí)驗(yàn)室提出,由于脂蛋白(a)[Lipoprotein(a), Lp(a)]中的apo(a)與Pig具有高度同源性,可以抑制病菌與Pig的結(jié)合,因此可能具有潛在的抗感染作用。為驗(yàn)證Lp(a)是否可與銅綠假單胞桿菌表面Tu特異性結(jié)合,進(jìn)而競(jìng)爭(zhēng)性抑制Pig與Tu的結(jié)合,本文進(jìn)行了如下研究：(1)在大腸桿菌中表達(dá)并純化了重組Tu (Recombinant Tu,rTu)蛋白及重組TA蛋白(Recombinant TuK394A, rTA),通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：①rTu、rTA蛋白與Pig、Lp(a)結(jié)合,與低密度脂蛋白(Low density lipoprotein, LDL)不結(jié)合,表明rTu與Lp(a)的結(jié)合可能與apo(a)有關(guān)。②賴氨酸類似分子6氨基己酸(ε-aminocaproic acid, EACA)對(duì)rTu蛋白與Pig、Lp(a)的結(jié)合有一定的抑制作用,表明rTu蛋白可能是與Pig、Lp上的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)(Lysine-binding sites, LBS)有關(guān)。③較高濃度的Lp(a)能抑制Pig與rTu的結(jié)合,表明Pig及Lp(a)與rTu的結(jié)合位點(diǎn)有相同之處。(2) ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：①Pig、Lp(a)和LDL都可以與銅綠假單胞桿菌結(jié)合,且不同生長(zhǎng)時(shí)期菌的結(jié)合值無(wú)顯著差異。②EACA對(duì)銅綠假單胞桿菌與Pig、Lp(a)的結(jié)合有一定的抑制作用,表明其結(jié)合與Pig、Lp上的上的LBS有關(guān)。(3)制備并純化得到鼠抗rTu多克隆抗體(Mouse anti-rTu IgG, rTu抗體)。通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：①rTu抗體能抑制rTu與Lp(a)的結(jié)合。②不同生長(zhǎng)時(shí)期銅綠假單胞桿菌表面Tu表達(dá)量有差異,但因該菌表面還有其他Lp(a)結(jié)合蛋白,因而不同生長(zhǎng)時(shí)期的銅綠假單胞桿菌與Lp(a)的結(jié)合能力并無(wú)顯著差異。
【關(guān)鍵詞】：脂蛋白(a) 纖溶酶原 銅綠假單胞桿菌 延長(zhǎng)因子Tu
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-12
• 縮略語(yǔ)表12-13
• 1 引言13-25
• 1.1 銅綠假單胞桿菌13-16
• 1.1.1 銅綠假單胞桿菌的毒力因子13-15
• 1.1.2 銅綠假單胞桿菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)15-16
• 1.1.3 銅綠假單胞桿菌多重耐藥性的基礎(chǔ)16
• 1.2 纖溶酶原與病原入侵16-19
• 1.2.1 纖溶酶原的結(jié)構(gòu)和功能16-18
• 1.2.2 病原菌利用宿主Plg的機(jī)制18-19
• 1.3 銅綠假單胞桿菌表面的纖溶酶原受體19-21
• 1.3.1 銅綠假單胞桿菌表面的纖溶酶原受體19-20
• 1.3.2 銅綠假單胞桿菌延長(zhǎng)因子Tu結(jié)構(gòu)20-21
• 1.4 脂蛋白(a)21-23
• 1.4.1 Lp(a)結(jié)構(gòu)21-22
• 1.4.2 Lp(a)在纖溶系統(tǒng)中的作用22
• 1.4.3 脂蛋白(a)的致病性22-23
• 1.5 立題依據(jù)23
• 1.6 研究?jī)?nèi)容23-25
• 1.6.1 銅綠假單胞桿菌與Lp(a)的結(jié)合24
• 1.6.2 重組銅綠假單胞桿菌翻譯延長(zhǎng)因子Tu與Lp(a)的結(jié)合24-25
• 2 實(shí)驗(yàn)材料25-31
• 2.1 儀器設(shè)備25
• 2.2 主要試劑25-31
• 2.2.1 化學(xué)試劑25-27
• 2.2.2 試劑盒和標(biāo)準(zhǔn)品27
• 2.2.3 填料及純化緩沖液27-29
• 2.2.4 培養(yǎng)基的配制29-30
• 2.2.5 菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30
• 2.2.6 PCR引物30-31
• 3 實(shí)驗(yàn)方法31-48
• 3.1 rTu的表達(dá)、純化31-38
• 3.1.1 銅綠假單胞桿菌的培養(yǎng)31
• 3.1.2 銅綠假單胞桿菌基因組DNA的提取31-32
• 3.1.3 基因組DNA的測(cè)定32
• 3.1.4 Tu的擴(kuò)增32
• 3.1.5 Tu擴(kuò)增產(chǎn)物的純化32-33
• 3.1.6 Tu與pGM-T的連接33
• 3.1.7 pGM-T-Tu轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli33
• 3.1.8 菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆33-34
• 3.1.9 基因序列測(cè)定34
• 3.1.10 Tu的酶切及純化34
• 3.1.11 提取pASK-IBA37質(zhì)粒34-35
• 3.1.12 pASK-IBA 37的酶切及純化35
• 3.1.13 Tu基因酶切產(chǎn)物與pASK-IBA 37載體的連接35-36
• 3.1.14 pASK-IBA37-Tu轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli BL2136
• 3.1.15 菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆36
• 3.1.16 陽(yáng)性克隆的雙酶切鑒定36
• 3.1.17 工程菌培養(yǎng)36-37
• 3.1.18 表達(dá)產(chǎn)物的分析37
• 3.1.19 rTu的純化37-38
• 3.1.20 蛋白濃度的測(cè)定38
• 3.2 rTA的表達(dá)和純化38-39
• 3.2.1 TA的擴(kuò)增及純化38-39
• 3.2.2 TA的酶切及純化39
• 3.2.3 TA與pASK-IBA37的連接39
• 3.2.4 pASK-IBA37-TA轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli39
• 3.2.5 菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆39
• 3.2.6 基因序列的測(cè)定39
• 3.2.7 工程菌的培養(yǎng)39
• 3.2.8 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析39
• 3.2.9 rTA的純化39
• 3.2.10 蛋白濃度的測(cè)定39
• 3.3 rT1或rT2的表達(dá)和純化39-40
• 3.3.1 T1、T2的擴(kuò)增及純化39-40
• 3.3.2 T1或T2的酶切及純化40
• 3.3.3 T1或T2與pASK-IBA37的連接40
• 3.3.4 pASK-IBA37-T1或pASK-IBA37-T2轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli40
• 3.3.5 菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆40
• 3.3.6 基因序列的測(cè)定40
• 3.3.7 工程菌的培養(yǎng)40
• 3.3.8 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析40
• 3.3.9 rT1或rT2的純化40
• 3.3.10 蛋白濃度的測(cè)定40
• 3.4 探索銅綠假單胞桿菌與Lp(a)的相互作用40-42
• 3.4.1 檢測(cè)銅綠假單胞桿菌與Plg或Lp(a)的結(jié)合40-41
• 3.4.2 檢測(cè)EACA對(duì)銅綠假單胞桿菌與Plg或Lp(a)結(jié)合的作用41-42
• 3.5 探索rTu與Lp(a)的相互作用42-43
• 3.5.1 檢測(cè)rTu與Plg、Lp(a)或LDL的結(jié)合42-43
• 3.5.2 檢測(cè)EACA對(duì)rTu與Pig或Lp(a)結(jié)合的抑制作用43
• 3.5.3 檢測(cè)Lp(a)對(duì)rTu與Plg結(jié)合的抑制作用43
• 3.6 檢測(cè)rTu、rTA、rT1或rT2與Plg或Lp(a)的結(jié)合43-44
• 3.6.1 檢測(cè)rTu、rTA、rT1或rT2與Plg的結(jié)合44
• 3.6.2 檢測(cè)rTu、rTA、rT1或rT2與Lp(a)的結(jié)合44
• 3.7 rTu抗體的制備及純化44-46
• 3.7.1 免疫用試劑的制備44
• 3.7.2 rTu免疫小鼠44-45
• 3.7.3 rTu抗體的純化45
• 3.7.4 檢測(cè)rTu抗體的稀釋比45-46
• 3.8 用rTu抗體研究rTu或銅綠假單胞桿菌與Lp(a)的相互作用46-48
• 3.8.1 檢測(cè)不同生長(zhǎng)時(shí)期銅綠假單胞桿菌表面Tu的表達(dá)量46
• 3.8.2 檢測(cè)rTu抗體對(duì)銅綠假單胞桿菌與Lp(a)結(jié)合的作用46-48
• 4 結(jié)果48-68
• 4.1 rTu的表達(dá)和純化48-55
• 4.1.1 銅綠假單胞桿菌在TSB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線48
• 4.1.2 銅綠假單胞桿菌基因組DNA的提取48-49
• 4.1.3 pGM-T質(zhì)粒示意圖49
• 4.1.4 Tu基因的擴(kuò)增49
• 4.1.5 重組質(zhì)粒pGM-T-Tu的構(gòu)建49-50
• 4.1.6 菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆50
• 4.1.7 Tu序列測(cè)定結(jié)果50-51
• 4.1.8 pASK-IBA37載體51
• 4.1.9 pASK-IBA37的酶切及純化51-52
• 4.1.10 Tu的雙酶切及純化52
• 4.1.11 Tu與pASK-IBA37的連接52
• 4.1.12 菌落PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌落52-53
• 4.1.13 BamHI、EcoRI雙酶切pASK-IBA37-Tu質(zhì)粒53
• 4.1.14 表達(dá)產(chǎn)物的分析53-54
• 4.1.15 rTu的純化54
• 4.1.16 蛋白含量的測(cè)定54-55
• 4.2 rTA的表達(dá)和純化55-56
• 4.2.1 TA的擴(kuò)增及純化55
• 4.2.2 菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆55-56
• 4.2.3 TA序列測(cè)定結(jié)果56
• 4.2.4 rTA的表達(dá)純化56
• 4.2.5 蛋白含量的測(cè)定56
• 4.3 rT1、rT2的表達(dá)和純化56-58
• 4.3.1 T1、T2的擴(kuò)增及純化56-57
• 4.3.2 菌落PCR鑒定T1或T2陽(yáng)性克隆57
• 4.3.3 rT1、rT2的表達(dá)純化57-58
• 4.3.4 蛋白濃度的測(cè)定58
• 4.4 探索銅綠假單胞桿菌與Lp(a)的相互作用58-60
• 4.4.1 檢測(cè)銅綠假單胞桿菌與Plg或Lp(a)的結(jié)合58-59
• 4.4.2 檢測(cè)EACA對(duì)銅綠假單胞桿菌與Plg或Lp(a)結(jié)合的作用59-60
• 4.5 rTu與Lp(a)的相互作用60-63
• 4.5.1 ELISA檢測(cè)rTu與Plg、Lp(a)或LDL的結(jié)合60-61
• 4.5.2 檢測(cè)EACA對(duì)rTu與Plg或Lp(a)結(jié)合的作用61-62
• 4.5.3 檢測(cè)Lp(a)對(duì)rTu與Plg結(jié)合的作用62-63
• 4.6 ELISA檢測(cè)rTA、rT1或rT2與Plg或Lp(a)的相互作用63-64
• 4.6.1 ELISA檢測(cè)rTu、rTA、rT1或rT2與Plg的結(jié)合63
• 4.6.2 ELISA檢測(cè)rTu、rTA、rT1或rT2與Lp(a)的結(jié)合63-64
• 4.7 rTu抗體的制備和純化64
• 4.8 探索rTu抗體的稀釋比64-66
• 4.8.1 rTu抗體與rTu結(jié)合時(shí)的稀釋比64-65
• 4.8.2 rTu抗體與銅綠假單胞桿菌結(jié)合時(shí)的稀釋比65-66
• 4.9 rTu抗體對(duì)rTu或銅綠假單胞桿菌與Lp(a)結(jié)合的作用66-68
• 4.9.1 不同生長(zhǎng)時(shí)期銅綠假單胞桿菌表面Tu表達(dá)量的差異66
• 4.9.2 rTu抗體對(duì)銅綠假單胞桿菌或rTu與Lp(a)結(jié)合的作用66-68
• 5 討論68-69
• 6 結(jié)論69-70
• 致謝70-71
• 參考文獻(xiàn)71-75
• 附錄75-80
• 作者簡(jiǎn)介80

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本文編號(hào)：450565