發(fā)布時(shí)間：2017-05-31 23:05

  本文關(guān)鍵詞：C型鈉肽對(duì)牛腔前卵泡體外生長(zhǎng)發(fā)育作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：胚胎工程相關(guān)技術(shù)的發(fā)展提高了卵母細(xì)胞的利用效率,改善了雌性動(dòng)物的生殖性能。然而,目前卵母細(xì)胞體外成熟(in vitro maturation,IVM)、體外受精(in vitro fertilization,IVF)等胚胎工程相關(guān)技術(shù),只限于從卵巢表面的有腔卵泡中獲取卵母細(xì)胞,因此其數(shù)量非常有限。眾所周知,雌性動(dòng)物的卵巢中含有大量腔前卵泡,如果能成功體外培養(yǎng)動(dòng)物的腔前卵泡至有腔卵泡階段,再?gòu)倪@些有腔卵泡中收集卵母細(xì)胞,用于體外受精等胚胎工程技術(shù)研究與應(yīng)用,進(jìn)一步促進(jìn)這些胚胎工程技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用范圍。C型鈉肽(C-type natriuretic peptide,CNP)是哺乳動(dòng)物卵泡內(nèi)天然存在的,鈉肽受體2(natriuretic peptide receptor 2,NPR2)是其特異性受體。有關(guān)CNP的報(bào)道大部分集中在其對(duì)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯和體外成熟中的作用,大量研究發(fā)現(xiàn)C型鈉肽可以維持哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的阻滯,使卵母細(xì)胞核成熟和胞質(zhì)成熟同步化,進(jìn)而提高卵母細(xì)胞的成熟率和后期胚胎的發(fā)育能力。最近有研究表明,CNP能促進(jìn)小鼠腔前卵泡發(fā)育。本研究以牛卵巢為試驗(yàn)材料,從牛卵巢上采用刮梳法分離牛腔前卵泡。在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加100 ng/mL CNP或聯(lián)合添加100 ng/mL FSH和100 ng/mL CNP體外培養(yǎng)150~300μm直徑的牛腔前卵泡12 d,結(jié)合FSH對(duì)牛腔前卵泡體外發(fā)育的作用,初步探索CNP對(duì)牛腔前卵泡體外生長(zhǎng)發(fā)育、存活、成腔以及卵泡發(fā)育相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響,以期為哺乳動(dòng)物腔前卵泡的體外培養(yǎng)提供基礎(chǔ)。試驗(yàn)研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1.從屠宰場(chǎng)收集牛卵巢,分離腔前卵泡,進(jìn)行體外培養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果顯示,基礎(chǔ)培養(yǎng)液α-MEM+中體外培養(yǎng)牛腔前卵泡12 d,卵泡存活率達(dá)到58.33±4.04%。這一結(jié)果為后續(xù)研究CNP對(duì)牛腔前卵泡體外生長(zhǎng)發(fā)育的影響提供了可能。2.基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別添加FSH、CNP以及FSH+CNP,體外培養(yǎng)牛腔前卵泡12 d,測(cè)量其在第0,4,8,12 d的卵泡直徑,統(tǒng)計(jì)卵泡直徑生長(zhǎng)變化情況。結(jié)果表明,FSH組和α-MEM+組的卵泡,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加卵泡直徑不斷增大;CNP組和FSH+CNP組的卵泡直徑隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì),但CNP組和FSH+CNP組牛腔前卵泡體外培養(yǎng)12 d后,卵泡腔形成率顯著高于FSH組和α-MEM+組(P0.05)。從以上結(jié)果我們分析,在體外培養(yǎng)條件下CNP可能促進(jìn)了未充分生長(zhǎng)發(fā)育的卵泡過早成腔。3.基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別添加FSH、CNP以及FSH+CNP,體外培養(yǎng)牛腔前卵泡12 d,統(tǒng)計(jì)卵泡存活率。結(jié)果顯示,FSH+CNP組腔前卵泡存活率顯著低于其他三組(α-MEM+、CNP和FSH組)(P0.05),而CNP組卵泡存活率顯著低于FSH組(P0.05),略低于α-MEM+組但差異不顯著(P0.05)。以上研究結(jié)果說明CNP可能降低了體外培養(yǎng)牛腔前卵泡存活率。4.利用反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR(quantificational real-time PCR,qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)牛腔前卵泡Npr2 mRNA以及發(fā)育和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示,牛腔前卵泡體外培養(yǎng)12 d,CNP組Npr2 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于其他三組(α-MEM+、FSH和FSH+CNP組),但差異不顯著(P0.05);發(fā)育相關(guān)基因FSHR、CYP19A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì);而PCNA mRNA相對(duì)表達(dá)量則逐漸升高;體外培養(yǎng)第12 d,CNP組和FSH+CNP組FSHR、CYP19A1、PCNA mRNA相對(duì)表達(dá)均低于其他兩組(α-MEM+和FSH組)。凋亡相關(guān)基因Bax和Apaf-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量都隨著培養(yǎng)天數(shù)增加而逐漸增加,FSH+CNP組和CNP組相對(duì)表達(dá)量均顯著高于α-MEM+組和FSH組(P0.05)。根據(jù)以上研究結(jié)果,基礎(chǔ)培養(yǎng)液添加CNP體外培養(yǎng)牛腔前卵泡12天,卵泡發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)降低,而凋亡相關(guān)基因表達(dá)升高,由此我們推測(cè)CNP可能不利于牛腔前卵泡生長(zhǎng)以及存活。以上研究結(jié)果表明,在體外培養(yǎng)條件下CNP能顯著促進(jìn)牛腔前卵泡成腔。然而,CNP顯著降低卵泡存活率,不利于體外培養(yǎng)的牛腔前卵泡生長(zhǎng)。因此,CNP在體外培養(yǎng)的牛腔前卵泡中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。
【關(guān)鍵詞】：C型鈉肽 體外培養(yǎng) 腔前卵泡 細(xì)胞凋亡 牛
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S814
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 文獻(xiàn)綜述13-31
• 第一章 哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育13-26
• 1.1 哺乳動(dòng)物卵泡的發(fā)生13-15
• 1.1.1 原始卵泡形成13-14
• 1.1.2 原始卵泡的激活與生長(zhǎng)14
• 1.1.3 卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育14-15
• 1.2 卵泡發(fā)育、閉鎖調(diào)控機(jī)制15-20
• 1.2.1 原始卵泡的發(fā)育調(diào)控15-16
• 1.2.2 卵泡發(fā)育的調(diào)控機(jī)制16-18
• 1.2.3 卵泡閉鎖調(diào)控機(jī)制18-20
• 1.3 哺乳動(dòng)物腔前卵泡體外培養(yǎng)20-26
• 1.3.1 腔前卵泡分離與選擇21
• 1.3.2 腔前卵泡體外培養(yǎng)方法21-22
• 1.3.3 腔前卵泡培養(yǎng)液22-26
• 第二章 C型鈉肽在動(dòng)物生殖調(diào)控中的作用26-31
• 2.1 C型鈉肽及其受體26-27
• 2.2 C型鈉肽與動(dòng)物生殖調(diào)控27-29
• 2.2.1 CNP的表達(dá)27
• 2.2.2 CNP與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂27-28
• 2.2.3 C型鈉肽調(diào)控動(dòng)物卵泡發(fā)育28-29
• 2.3 激素與細(xì)胞因子對(duì)CNP/NPR2表達(dá)水平的調(diào)控29-30
• 2.4 C型鈉肽的作用機(jī)制30-31
• 試驗(yàn)研究31-52
• 第三章 C型鈉肽對(duì)牛腔前卵泡體外發(fā)育的影響31-40
• 3.1 材料與方法31-34
• 3.1.1 試驗(yàn)材料31-32
• 3.1.2 試驗(yàn)方法32-34
• 3.2 結(jié)果與分析34-37
• 3.2.1 不同處理牛腔前卵泡體外生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)34
• 3.2.2 不同處理牛腔前卵泡直徑變化34-35
• 3.2.3 體外培養(yǎng)牛腔前卵泡存活鑒定與存活結(jié)果35-37
• 3.2.4 體外培養(yǎng)牛腔前卵泡成腔結(jié)果37
• 3.3 討論37-39
• 3.4 小結(jié)39-40
• 第四章 C型鈉肽對(duì)牛腔前卵泡發(fā)育及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響40-52
• 4.1 材料與方法40-43
• 4.1.1 試驗(yàn)材料40-41
• 4.1.2 試驗(yàn)方法41-43
• 4.2 結(jié)果與分析43-47
• 4.2.1 不同處理牛腔前卵泡Npr2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平43-44
• 4.2.2 不同處理牛腔前卵泡發(fā)育相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平44-46
• 4.2.3 不同處理牛腔前卵泡凋亡相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平46-47
• 4.3 討論47-51
• 4.3.1 不同處理牛腔前卵泡中Npr2 mRNA的表達(dá)變化47
• 4.3.2 不同處理牛腔前卵泡中發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)變化47-50
• 4.3.3 不同處理牛腔前卵泡中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化50-51
• 4.4 小結(jié)51-52
• 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-67
• 致謝67-68
• 作者簡(jiǎn)介68

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