本研究旨在克隆、表達(dá)鴨干擾素刺激基因(interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats 5,IFIT5)并制備其多克隆抗體。根據(jù)GenBank公布的綠頭鴨IFIT5(登錄號:KF956064)序列設(shè)計(jì)特異性引物,PCR擴(kuò)增獲得鴨IFIT5基因,并構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-30a-IFIT5和pET-32a-IFIT5及真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IFIT5。原核表達(dá)獲得鴨IFIT5重組蛋白后,進(jìn)行SDS-PAGE分析,并利用鎳柱親和層析方法對重組蛋白進(jìn)行純化。以純化的鴨IFIT5重組蛋白為免疫原制備兔抗鴨IFIT5多克隆抗體。利用間接ELISA測定多克隆抗體效價(jià)、用Western blotting鑒定其特異性;將真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IFIT5轉(zhuǎn)化BHK21細(xì)胞,通過間接免疫熒光法鑒定多克隆抗體的反應(yīng)性。結(jié)果表明:目的蛋白主要以包涵體的形式存在;制備的兔抗鴨IFIT5多克隆抗體效價(jià)達(dá)1∶49 600,可特異性識別鴨IFIT5重組蛋白,間接免疫熒光試驗(yàn)則表明純化的多克隆抗體可特異性識別BHK21瞬時(shí)真...

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圖1 鴨IFIT5基因的克隆及鑒定

以實(shí)驗(yàn)室保存的鴨外周血淋巴細(xì)胞cDNA為模板,PCR擴(kuò)增得到鴨IFIT5基因。1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,在退火溫度為50℃時(shí)出現(xiàn)明顯的特異性目的條帶,約1440bp(圖1A)。經(jīng)大體系PCR、切膠回收后連接至pMD18-T載體上,獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-IFIT5....

圖2 鴨IFIT5基因的克隆及原核表達(dá)重組質(zhì)粒的鑒定

以重組質(zhì)粒pMD-18T-IFIT5為模板,PCR擴(kuò)增獲得含有Kozak序列的IFIT5基因,約1440bp(圖3A),并將其連接到pcDNA3.1(+)載體上,獲得真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IFIT5,該質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定,獲得大小約為5460bp和1440bp....

圖3 含有Kozak序列IFIT5基因的克隆及真核表達(dá)重組質(zhì)粒的鑒定

圖2鴨IFIT5基因的克隆及原核表達(dá)重組質(zhì)粒的鑒定2.4鴨IFIT5基因的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)形式分析

圖4 鴨IFIT5基因的原核表達(dá)及表達(dá)形式分析

將pET-30a(+)、pET-32a(+)空載體及重組質(zhì)粒pET-30a-IFIT5、pET-32a-IFIT5轉(zhuǎn)化Rosetta感染態(tài)細(xì)胞,IPTG對重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)形式,其中,重組蛋白pET-30a-IFIT5大小為58.7ku左右....

本文編號：4033717