細(xì)胞自噬是一種溶酶體依賴(lài)性的降解途徑,在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。越來(lái)越多的研究顯示,細(xì)胞自噬在不同病毒感染的過(guò)程中扮演著不同的角色,同樣病毒對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制也不盡相同。此外,細(xì)胞自噬還跟天然免疫存在著密切的關(guān)系。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成的重要場(chǎng)所,在蛋白的翻譯和修飾過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,病毒復(fù)制過(guò)程中往往導(dǎo)致大量未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的堆積而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,進(jìn)而誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR), UPR同樣跟病毒的增殖存在重要的關(guān)系。此外,UPR可以調(diào)控細(xì)胞自噬的水平。 豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)以引起妊娠母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀為主要特征,具有較高的死亡率。盡管隨著研究的深入取得了一系列的研究成果,但針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染引起的免疫抑制及其對(duì)細(xì)胞的具體調(diào)控機(jī)制仍不甚明了。鑒于此,本研究深入探討了PRRSV感染后自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)情況。主要研究?jī)?nèi)容包括： 1. PRRSV感染誘導(dǎo)自噬體的形成 為確定PRRSV感染是否誘導(dǎo)自噬體的形成,首先通過(guò)Western Blot的方法檢測(cè)PRRSV感染后II型微管結(jié)合蛋白輕鏈3(L...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 自噬研究進(jìn)展
        1.1.1 自噬的種類(lèi)及過(guò)程
        1.1.2 細(xì)胞自噬的分子機(jī)制
        1.1.3 自噬的信號(hào)調(diào)節(jié)
    1.2 細(xì)胞自噬的研究方法
        1.2.1 自噬體的形成
        1.2.2 自噬體的降解
    1.3 自噬與免疫及病毒感染
        1.3.1 自噬與病毒感染
        1.3.2 自噬與免疫
        1.3.3 自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
    1.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激概述
        1.4.1 未折疊蛋白反應(yīng)的途徑
        1.4.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與病毒感染
        1.4.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡
        1.4.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和疾病
    1.5 豬繁殖與呼吸綜合征研究進(jìn)展
第2章 研究目的與意義
第3章 材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 細(xì)胞、毒株、菌株
        3.1.2 載體與質(zhì)粒
        3.1.3 工具酶及主要試劑
        3.1.4 抗體、si RNA及主要化學(xué)試劑
        3.1.5 培養(yǎng)基與抗生素及其配制
        3.1.6 主要緩沖液與相關(guān)試劑及其配制
        3.1.7 主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備
        3.1.8 分子生物學(xué)分析軟件
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.2 Western Blot實(shí)驗(yàn)
        3.2.3 siRNA及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
        3.2.4 間接免疫熒光
        3.2.5 Lyso-Tracker Red染色
        3.2.6 激光共聚焦顯微鏡觀察
        3.2.7 雙熒光素酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
        3.2.8 MTS法檢測(cè)細(xì)胞活性
        3.2.9 透射電鏡
        3.2.10 熒光定量、半定量PCR
        3.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
第4章 結(jié)果與分析
    4.1 PRRSV感染誘導(dǎo)自噬體的形成
        4.1.1 EGFP-LC3融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.1.2 PRRSV感染MARC-145細(xì)胞后LC3的表達(dá)變化
        4.1.3 PRRSV感染MARC-145細(xì)胞誘導(dǎo)自噬體的形成
        4.1.4 電鏡觀察PRRSV感染MARC-145細(xì)胞后自噬體的形成
    4.2 PRRSV感染促進(jìn)自噬體的降解
        4.2.1 Lyso-Tracker和LC3的共定位分析
        4.2.2 LC3-Ⅱ的周轉(zhuǎn)分析
        4.2.3 p62的降解分析
    4.3 細(xì)胞自噬促進(jìn)PRRSV增殖
        4.3.1 誘導(dǎo)細(xì)胞自噬促進(jìn)PRRSV的增殖
        4.3.2 抑制細(xì)胞自噬抑制PPRSV的增殖
        4.3.3 干擾細(xì)胞自噬相關(guān)基因抑制PRRSV的增殖
        4.3.4 阻斷自噬體的降解抑制PRRSV增殖
    4.4 PRRSV誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的機(jī)制研究
    4.5 抑制細(xì)胞自噬PRRSV對(duì)干擾素的抑制得到恢復(fù)
    4.6 PRRSV感染誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
        4.6.1 PRRSV引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹
        4.6.2 PRRSV感染誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)
    4.7 PRRSV感染MARC-145細(xì)胞激活PERK途徑
        4.7.1 PRRSV感染透導(dǎo)eIF2α的磷酸化
        4.7.2 PRRSV感染MARC-145細(xì)胞激活A(yù)TF4的表達(dá)
        4.7.3 PRRSV感染MARC-145細(xì)胞激活GADD34的表達(dá)
    4.8 PRRSV感染MARC-145細(xì)胞激活I(lǐng)RE1途徑
        4.8.1 PRRSV感染MARC-145細(xì)胞激活Xbp1 mRNA的切割
        4.8.2 PRRSV感染MARC-145細(xì)胞激活ERSE和UPRE
        4.8.3 PRRSV感染MARC-145細(xì)胞激活EDEM的表達(dá)
    4.9 PRRSV感染MARC-145細(xì)胞不激活A(yù)TF6途徑
        4.9.1 PRRSV感染MARC-145細(xì)胞不能誘導(dǎo)ATF6的切割
        4.9.2 PRRSV感染MARC-145細(xì)胞不能激活A(yù)TF6誘導(dǎo)的伴侶分子的表達(dá)
    4.10 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)PRRSV增殖
        4.10.1 緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制PRRSV的增殖
        4.10.2 干擾UPR抑制PRRSV的增殖
    4.11 PRRSV感染介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
        4.11.1 PRRSV感染激活CHOP啟動(dòng)子
        4.11.2 PRRSV感染激活CHOP mRNA的表達(dá)
        4.11.3 PRRSV感染激活CHOP誘導(dǎo)的caspase 3的表達(dá)
    4.12 抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制了PRRSV誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬
        4.12.1 4-PBA處理抑制細(xì)胞自噬
        4.12.2 干擾PERK和IRE1抑制細(xì)胞自噬
第5章 討論與結(jié)論
    5.1 討論
        5.1.1 PRRSV感染MARC-145細(xì)胞誘導(dǎo)完全細(xì)胞自噬
        5.1.2 細(xì)胞自噬促進(jìn)PRRSV的增殖
        5.1.3 PRRSV誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬與天然免疫的關(guān)系
        5.1.4 PRRSV感染誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)
        5.1.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)PRRSV增殖
        5.1.6 PRRSV感染誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
        5.1.7 PRRSV感染誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控細(xì)胞自噬
    5.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄



本文編號(hào)：4030040