miRNAs是一類長度約為18～24 nt的小分子單鏈非編碼RNA,能夠參與動物基因轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控,在動物生長、發(fā)育、激素分泌及疾病發(fā)生等生命活動中均起到極其重要的作用。牛肉優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)是當(dāng)前肉牛分子育種研究的重點和熱點,牛肉高產(chǎn)主要涉及肉牛肌肉組織發(fā)育,牛肉優(yōu)質(zhì)主要涉及肉牛脂肪組織發(fā)育。因此,本項目以秦川牛為研究對象,構(gòu)建秦川牛背部肌肉組織及背部皮下脂肪組織不同發(fā)育階段小RNA測序文庫,篩選組織特異性和時序特異性表達mi RNAs。然后利用實時定量PCR技術(shù)驗證測序結(jié)果和進行組織表達譜分析,通過雙熒光素酶報告基因試驗確定重要功能mi RNA的靶基因。進一步通過mi RNA模擬物和抑制劑分別過表達或敲低重要功能mi RNAs,研究其對牛肌衛(wèi)星細胞增殖分化的影響,以便為秦川牛肉用選育提供新的理論依據(jù)及牛肉的優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。本次研究主要工作及結(jié)果如下:1.秦川牛不同發(fā)育階段肌肉組織小RNA鑒定與分析分別構(gòu)建秦川牛胚胎期90天、胚胎期200天、出生后5日齡犢牛、12月齡青年牛及24月齡成年牛背部肌肉組織小RNA測序文庫,利用深度測序的方法鑒定秦川牛肌肉組織不同發(fā)育階段mi RNA表達規(guī)律...

【文章頁數(shù)】：148 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
第一章 文獻綜述
    1.1 肉牛生長與牛肉品質(zhì)評定
    1.2 肌肉的形成和發(fā)育
        1.2.1 肌肉生長發(fā)育的生物學(xué)規(guī)律
        1.2.2 肌肉生長發(fā)育的功能基因及其調(diào)控機理
    1.3 脂肪組織的形成和發(fā)育
        1.3.1 脂肪細胞分化的生物學(xué)規(guī)律
        1.3.2 脂肪細胞分化的功能基因及其調(diào)控機理
    1.4 肉牛肌肉與脂肪發(fā)育及其代謝調(diào)控
        1.4.1 胎牛肌肉發(fā)育與營養(yǎng)
        1.4.2 胎牛肌內(nèi)脂肪的發(fā)育
        1.4.3 Wnt/β-catenin信號通路與肌分化
    1.5 miRNA的研究進展
        1.5.1 miRNA的形成及作用機制
        1.5.2 miRNAs靶基因預(yù)測及鑒定
        1.5.3 miRNA在肌肉發(fā)育過程中的作用
        1.5.4 miRNA調(diào)控脂肪細胞分化
    1.6 牛miRNAs的研究現(xiàn)狀
    1.7 miRNA測序
    1.8 本研究的目的和意義
第二章 不同發(fā)育時期秦川牛肌肉組織小RNA測序及miRNAs鑒定
    2.1 材料和方法
        2.1.1 實驗動物及組織樣品采集
        2.1.2 總RNA的提取
        2.1.3 小RNA測序文庫構(gòu)建
        2.1.4 測序結(jié)果初步處理
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 總RNA提取及質(zhì)量檢測
        2.2.2 序列質(zhì)量處理及長度分布
        2.2.3 基因組比對及分類注釋
        2.2.4 已知miRNA鑒定
        2.2.5 新的miRNA預(yù)測
    2.3 小結(jié)
第三章 秦川牛背部脂肪組織小RNA測序及miRNAs鑒定
    3.1 材料和方法
        3.1.1 實驗動物及組織樣品采集
        3.1.2 總RNA的提取
        3.1.3 小RNA測序文庫構(gòu)建
        3.1.4 測序結(jié)果初步處理
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 總RNA提取及質(zhì)量檢測
        3.2.2 序列質(zhì)量處理及長度分布
        3.2.3 兩文庫中小RNA共有和特有序列分析
        3.2.4 基因組比對及分類注釋
        3.2.5 已知miRNAs鑒定與新miRNAs預(yù)測
    3.3 小結(jié)
第四章 miRNA表達譜特征分析
    4.1 數(shù)據(jù)來源
    4.2 分析方法
        4.2.1 miRNA成熟體堿基偏向性研究
        4.2.2 miRNAs變異體（isomiRs）分析
        4.2.3 miRNAs堿基編輯
        4.2.4 組織特異性miRNA表達
        4.2.5 miRNAs共表達分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 堿基偏向性
        4.3.2 miRNA isomiRs
        4.3.3 miRNA的SNP分析
        4.3.4 組織特異性miRNAs鑒定
        4.3.5 miRNA共表達分析
    4.4 小結(jié)
第五章 秦川牛肌肉組織生長發(fā)育相關(guān)miRNAs鑒定及功能預(yù)測
    5.1 材料和方法
        5.1.1 試驗動物及組織樣品的采集
        5.1.2 總RNA提取及質(zhì)量檢測
        5.1.3 cDNA合成及質(zhì)量檢測
        5.1.4 篩選秦川牛肌肉組織時序特異性miRNAs
        5.1.5 miRNA的stem-loop RT-qPCR分析
        5.1.6 出生前后肌肉組織顯著差異表達miRNA靶基因預(yù)測
        5.1.7 靶基因功能注釋
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 總RNA提取及cDNA合成
        5.2.2 秦川牛肌肉組織時序特異性miRNAs鑒定
        5.2.3 miRNA組織表達譜分析
        5.2.4 靶基因預(yù)測分析
        5.2.5 已知差異表達miRNA靶基因GO和Pathway注釋分析
    5.3 小結(jié)
第六章 秦川牛背部脂肪組織時序特異性miRNAs鑒定及功能預(yù)測
    6.1 材料與方法
        6.1.1 試驗動物及組織樣品的采集
        6.1.2 總RNA提取及質(zhì)量檢測
        6.1.3 cDNA合成及質(zhì)量檢測
        6.1.4 篩選胎牛期和成年期秦川牛背部脂肪組織差異表達miRNA
        6.1.5 miRNA的stem-loop RT-qPCR分析
        6.1.6 靶基因預(yù)測及功能注釋
    6.2 結(jié)果與分析
        6.2.1 秦川牛脂肪組織時序特異性miRNAs鑒定
        6.2.2 miRNA組織表達譜分析
        6.2.3 靶基因預(yù)測及注釋分析
    6.3 小結(jié)
第七章 秦川牛肌肉發(fā)育相關(guān)miRNA-10020靶基因鑒定及功能研究
    7.1 材料與方法
        7.1.1 試驗動物及組織樣品的采集
        7.1.2 總RNA提取及cDNA合成
        7.1.3 靶基因預(yù)測及功能注釋
        7.1.4 肌肉生長發(fā)育相關(guān)的靶基因組織表達譜分析
        7.1.5 雙熒光素酶報告基因重組載體的構(gòu)建
        7.1.6 雙熒光素酶活性檢測
        7.1.7 構(gòu)建pDsRed1-N1- ANGPT1重組載體
        7.1.8 miR-10020 mimics干擾ANGPT1表達
        7.1.9 過表達或敲低miR-10020對肌細胞增殖分化的影響
    7.2 結(jié)果與分析
        7.2.1 miRNA-10020靶基因預(yù)測及功能注釋
        7.2.2 肌肉生長發(fā)育相關(guān)的靶基因組織表達譜分析
        7.2.3 psiCHECK-2 重組載體構(gòu)建及鑒定
        7.2.4 熒光素酶驗證
        7.2.5 miRNA-10020阻止ANGPT1轉(zhuǎn)錄本翻譯
        7.2.6 過表達或敲低miR-10020對牛衛(wèi)星細胞增殖分化影響
    7.3 小結(jié)
第八章 討論
    8.1 實驗動物及樣品采集
    8.2 miRNAs鑒定與組織表達譜分析
    8.3 新miRNA預(yù)測
    8.4 組織時序特異性miRNAs鑒定與功能研究
    8.5 miRNA-10020功能研究
第九章結(jié)論與創(chuàng)新點
    9.1 結(jié)論
    9.2 創(chuàng)新點
    9.3 進一步的研究內(nèi)容
參考文獻
附錄
致謝
作者簡介



本文編號：4029462