為了克隆豬圓環(huán)病毒3型Cap基因并進(jìn)行序列分析和原核表達(dá),參考GenBank上已發(fā)表的PCV3(KY418606.1)Cap基因序列,合成1對(duì)上、下游引物,PCR擴(kuò)增Cap基因,進(jìn)行序列分析和原核表達(dá)。結(jié)果顯示,成功克隆到642 bp的Cap基因,核苷酸序列分析顯示,PCV3 Cap基因與國(guó)內(nèi)分離株核苷酸同源性最高為95.97%,氨基酸分析顯示Cap蛋白不含信號(hào)肽和跨膜區(qū)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得了分子質(zhì)量約35 ku的Cap蛋白,該蛋白能與PCV3陽(yáng)性血清結(jié)合,具備良好的抗原性。成功克隆并原核表達(dá)PCV3陜西株Cap基因,為進(jìn)一步建立PCV3的快速檢測(cè)方法和研制PCV3亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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圖1 PCV3陜西株Cap基因的PCR擴(kuò)增

以BamHⅠ和XhoⅠ兩個(gè)限制性內(nèi)切酶雙酶切重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,出現(xiàn)1條約642bp的目的條帶,以及1條約5360bp的載體條帶(圖2),表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖2重組質(zhì)粒pET-28a-Cap的雙酶切鑒定

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a-Cap的雙酶切鑒定

圖1PCV3陜西株Cap基因的PCR擴(kuò)增2.3Cap基因生物信息學(xué)分析

圖3 Cap蛋白的生物信息學(xué)分析

在分析陜西株P(guān)CV3-Cap基因同源性的基礎(chǔ)上,繪制Cap基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4),從進(jìn)化樹(shù)可知,陜西分離株Cap基因與韓國(guó)分離株(KY996345.1)、美國(guó)分離株(KX778720.1)、中國(guó)重慶分離株(KY075994.1)在同一進(jìn)化分支上。不同來(lái)源的PCV3分離株....

圖4 Cap核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖3Cap蛋白的生物信息學(xué)分析2.4重組Cap蛋白的原核表達(dá)

本文編號(hào)：4014003