本文關鍵詞：塔里木馬鹿茸間充質(zhì)干細胞軟骨誘導分化及c-myc基因的表達，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：鹿茸在我國中醫(yī)藥典中是珍貴的中醫(yī)藥材,具有較高的經(jīng)濟價值,其快速生長和割后再生的特點是哺乳動物器官中獨有的,成為國內(nèi)外研究的熱點。c-myc基因是原癌基因家族中的一種轉(zhuǎn)錄因子,研究發(fā)現(xiàn)在很多癌癥組織中上調(diào)表達,對正常組織細胞具有調(diào)控增殖、分化和細胞凋亡等多種功能,塔里木馬鹿是新疆南部地區(qū)重要的經(jīng)濟動物之一,以塔里木馬鹿茸為材料研究其間充質(zhì)干細胞(MSCs)培養(yǎng)模式及細胞的生物學特性,建立鹿茸MSCs體外軟骨分化模型為鹿茸生長發(fā)育的研究和人類軟骨發(fā)育及骨疾病研究提供基礎;同時研究體外誘導MSCs軟骨分化過程中c-myc基因的表達特征,為鹿茸快速生長機制的研究提供理論支持。1、實驗利用酶消化法和組織塊法相結合成功獲得鹿茸MSCs,體外培養(yǎng)的組織塊1d貼壁,2 d后有細胞遷出,6 d時細胞數(shù)量達到高峰。傳代培養(yǎng)的2-6代細胞在培養(yǎng)到4 d時細胞增殖達到高峰。原代培養(yǎng)細胞呈梭形,細胞核呈橢圓形,細胞呈菊花狀排列生長;傳代細胞形態(tài)呈梭形,排列無規(guī)則。5%的二甲基亞砜作為冷凍液可將細胞冷凍時間達到30 d以上且不影響其復蘇和生長。2、在培養(yǎng)液中加入10 ng/mL TGFβ1、10~（-7） M地塞米松和50μg/mL抗壞血酸作為誘導培養(yǎng)基,成功體外誘導鹿茸MSCs向軟骨分化,結果顯示,在誘導第7 d的細胞開始少量表達Ⅱ型膠原基因(Co LⅡ),但是未檢測到蛋白的表達。從誘導14 d至21 d細胞CoLⅡ表達量增加,阿利新藍和甲苯胺藍染色鑒定蛋白多糖結果逐漸達強陽性。在誘導21 d可獲得軟骨樣細胞,細胞CoLⅡ的表達顯著高于其他誘導天數(shù)的細胞(p0.05),免疫組化鑒定胞外Ⅱ型膠原蛋白的量呈陽性。誘導28 d的細胞CoLⅡ的表達量降低,Ι型膠原(CoLΙ)的表達量顯著增高(p0.05),胞外蛋白多糖積累量開始下降,茜素紅鑒定細胞Ca~（2+）分泌結果呈陽性,說明細胞進入肥大成熟期,之后開始向骨細胞分化;誘導35 d的細胞CoLⅡ和CoLΙ的表達量均降低,胞外蛋白多糖積累量達到最低,Ca~（2+）和膠原量顯著高于其他誘導天數(shù)的細胞(p0.05)。3、在誘導鹿茸MSCs向軟骨分化過程中,c-myc基因整體呈下調(diào)表達,在誘導7 d的細胞c-myc表達量最高,之后隨誘導時間逐漸下調(diào)表達至21 d達到最低,之后雖有上升趨勢但與第7 d的表達量相比沒有顯著差異。綜上所述,10 ng/mL TGFβ_1可成功誘導塔里木馬鹿茸間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化,分化后的細胞具有分泌軟骨標志物的功能。初步認為細胞軟骨分化過程中c-myc的下調(diào)表達誘導了鹿茸MSCs軟骨分化的發(fā)生。
【關鍵詞】：塔里木馬鹿 鹿茸 間充質(zhì)干細胞(MSCs) 誘導分化 c-myc基因
【學位授予單位】：塔里木大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S825
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-11
• 第1章 文獻綜述11-21
• 1.1 新疆塔里木馬鹿概述11-13
• 1.2 鹿茸13-15
• 1.2.1 鹿茸的生長特點13-14
• 1.2.2 鹿茸快速生長的研究進展14-15
• 1.3 鹿茸間充質(zhì)干細胞（MSCs）15-16
• 1.4 原癌基因c-myc16-18
• 1.5 實驗技術18-19
• 1.5.1 細胞培養(yǎng)技術18-19
• 1.5.2 熒光定量PCR技術19
• 1.6 研究目的意義19-21
• 第2章 塔里木馬鹿茸間充質(zhì)干細胞（MSCs）的體外培養(yǎng)21-30
• 2.1 材料與方法21-25
• 2.1.1 實驗樣品來源21-22
• 2.1.2 主要儀器22
• 2.1.3 主要試劑22
• 2.1.4 溶液配制22-23
• 2.1.5 實驗方法23-25
• 2.2 結果與分析25-28
• 2.2.1 原代培養(yǎng)25-26
• 2.2.2 細胞傳代培養(yǎng)26
• 2.2.3 細胞凍存和復蘇26-27
• 2.2.4 細胞爬片HE染色27
• 2.2.5 生長曲線的分析27-28
• 2.3 討論28-29
• 2.4 小結29-30
• 第3章 體外誘導塔里木馬鹿茸MSCs軟骨分化的實驗研究30-49
• 3.1 材料與方法31-36
• 3.1.1 主要材料31
• 3.1.2 實驗方法31-36
• 3.1.3 統(tǒng)計分析36
• 3.2 結果與分析36-46
• 3.2.1 不同誘導組細胞形態(tài)學觀察36-37
• 3.2.2 細胞RNA提取37
• 3.2.3 不同誘導劑下鹿茸MSCs軟骨分化的CoLⅡ和CoLⅠ的相對表達37-39
• 3.2.4 誘導分化不同階段5種方法的檢測結果39-46
• 3.3 討論46-48
• 3.3.1 誘導細胞和條件的篩選46
• 3.3.2 鹿茸MSCs軟骨分化過程中CoLⅡ和Ca~（2+）分泌變化特征46-48
• 3.3.3 鹿茸MSCs軟骨分化過程中蛋白多糖分泌的變化特征48
• 3.4 小結48-49
• 第4章 塔里木馬鹿茸MSCs軟骨分化過程中c-myc基因的表達變化49-53
• 4.1 材料與方法49-50
• 4.1.1 儀器與試劑49
• 4.1.2 實驗方法49-50
• 4.2 結果50-51
• 4.2.1 細胞c-myc基因在誘導分化過程中的相對表達結果50-51
• 4.3 討論51-52
• 4.4 小結52-53
• 結論53-54
• 參考文獻54-63
• 附錄63-65
• 致謝65-66
• 作者簡介66

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