【目的】建立檢測(cè)兔源強(qiáng)毒力金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的雙重PCR檢測(cè)方法,為兔葡萄球菌病的診斷提供技術(shù)支持�！痉椒ā扛鶕�(jù)兔源金黃色葡萄球菌的nuc和pvl兩種毒力基因的保守序列分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增,對(duì)雙重PCR反應(yīng)體系的混合引物濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,對(duì)雙重PCR檢測(cè)方法的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。【結(jié)果】當(dāng)雙重PCR反應(yīng)體系混合引物的濃度為0.6μmol·L-1、退火溫度為59.6℃時(shí),雙重PCR的擴(kuò)增效果最優(yōu)。該雙重PCR檢測(cè)方法特異性好,能擴(kuò)增出兔源強(qiáng)毒力金黃色葡萄球菌的nuc(320 bp)和pvl(585 bp)基因片段以及低毒力菌株的nuc(320 bp)基因片段,對(duì)兔源多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌和大腸桿菌等4種常見兔源細(xì)菌性病原菌以及陰性對(duì)照均無交叉反應(yīng)。該方法敏感性高,能分別檢出10 pg和100 fg的強(qiáng)毒力和低毒力兔源金黃色葡萄球菌基因組DNA。該方法重復(fù)性好,批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均為0;該方法準(zhǔn)確性好,對(duì)119份臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果與已報(bào)道的檢測(cè)金黃色葡萄球菌nuc和pvl...

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【部分圖文】：

圖1單重PCR擴(kuò)增結(jié)果

將強(qiáng)毒力菌株或低毒力菌株基因組DNA的量固定為100ng進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明混合引物濃度為0.4μmol·L-1、退火溫度為58℃時(shí)能分別擴(kuò)增出強(qiáng)毒力菌株的nuc和pvl基因片段和低毒力菌株的nuc基因片段（圖2）。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)反應(yīng)體系中混合引物的濃度和退火溫度....

圖3雙重PCR檢測(cè)方法引物濃度優(yōu)化

圖2雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果圖4雙重PCR檢測(cè)方法退火溫度優(yōu)化

圖4雙重PCR檢測(cè)方法退火溫度優(yōu)化

圖3雙重PCR檢測(cè)方法引物濃度優(yōu)化2.3雙重PCR檢測(cè)方法的特異性

圖5雙重PCR檢測(cè)方法特異性

應(yīng)用建立的雙重PCR方法檢測(cè)3組已知結(jié)果的樣品（每組20份，共60份），重復(fù)3次，結(jié)果顯示，重復(fù)性試驗(yàn)批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均為0，表明該雙重PCR方法具有良好的重復(fù)性。圖6雙重PCR檢測(cè)方法敏感性

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