發(fā)布時間：2017-05-27 02:07

  本文關(guān)鍵詞：牛miR-30-5p在骨骼肌中的表達與功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是一類長度只有22個左右核苷酸的單鏈非編碼RNA�，F(xiàn)已表明,miRNA在肌肉的生長發(fā)育過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。TargetScan預(yù)測MBNL基因家族為miR-30-5p靶基因。MBNL蛋白家族成員均為可變剪切調(diào)控因子,其中MBNL1能夠使肌肉相關(guān)基因INSR的mRNA中exon11和Trim55的mRNA中的exon9在轉(zhuǎn)錄過程中不被切掉,而INSR被發(fā)現(xiàn)能夠參與到與肌肉發(fā)育有關(guān)的信號通路中。MBNL1和MBNL3被報道在肌肉發(fā)育過程中具有重要的功能。本研究通過生物信息學(xué)的方法分析了miR-30-5p中的三個成員的在染色體上的位置及其相互間的保守性以及各自物種間的保守性。利用qPCR、Western Blot、siRNA干擾及雙熒光素酶報告載體系統(tǒng)的方法分別研究了mi R-30-5p在牛心、肝、脾、肺、腎、骨骼肌和脂肪等組織中的表達譜、其在肌肉分化中的作用,驗證了其與其靶基因MBNL之間的靶向關(guān)系、分析了MBNL1對肌肉分化的影響,探究了miR-30-5p對MBNL1下游基因INSR和Trim55基因可變剪切的影響。本研究的實驗結(jié)果如下:(1)通過序列保守性分析,發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p、miR-30b-5p和miR-30e-5p之間以及它們在人、小鼠和牛的物種間的保守性都很高;(2)胎牛、犢牛和成年牛不同組織(心、肝、脾、肺、腎、骨骼肌和脂肪)的表達譜分析結(jié)果顯示,miR-30-5p在心、肺、腎和骨骼肌中表達量較高,且miR-30b-5p在胎牛、犢牛和成年牛之間的表達量有顯著性的差異(p0.05),顯示了miR-30-5p在肌肉發(fā)育過程中所具有的重要作用;(3)成功構(gòu)建了mi R-30a-5p、miR-30b-5p和miR-30e-5p的pcDNA3.1(+)的過表達載體,成功構(gòu)建了MBNL1、MBNL2和MBNL3的3’UTR片段的熒光素酶報告載體及其突變型載體;(4)在C2C12細胞中過表達miR-30-5p,發(fā)現(xiàn)肌肉分化標(biāo)記分子MyoG和MHC的mRNA表達量顯著下降(p0.05),Western Blot實驗證明MyoG和MHC的蛋白表達量也得到抑制,標(biāo)記分子的表達量被下調(diào)充分證明了,miR-30-5p能夠抑制肌肉的分化;(5)雙熒光素酶報告實驗和Western Blot的實驗結(jié)果證實了這一預(yù)測結(jié)果,即mi R-30a-5p和miR-30e-5p能夠下調(diào)MBNL1、MBNL2和MBNL3基因的表達量(p0.05),mi R-30b-5p能夠下調(diào)MBNL1和MBNL2的表達量(p0.05);(6)RNAi實驗中,MyoG和MHC的mRNA(p0.05)和蛋白水平均被下調(diào),證明了MBNL1能夠促進肌肉的分化;(7)mi R-30-5p過表達載體轉(zhuǎn)染C2C12細胞后,qPCR檢測發(fā)現(xiàn)INSR的exon11和Trim55的exon9的表達量下降(p0.05),證明了該miR-30-5p能夠促進INSR的成熟mRNA中exon11的缺失,促進Trim55成熟mRNA中exon9的缺失。綜上所述,mi R-30-5p能夠靶向下調(diào)MBNL的表達量,進而能夠抑制肌肉的分化。
【關(guān)鍵詞】：牛 miR-30-5p 肌肉分化 MBNL 可變剪切
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S823
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 文獻綜述13-25
• 第一章 骨骼肌發(fā)育概述13-19
• 1.1 骨骼肌的發(fā)育13
• 1.2 骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)通路13-16
• 1.2.1 肌肉的肥大14
• 1.2.2 PI3K/Akt信號通路14
• 1.2.3 EPK信號通路14
• 1.2.4 mTOR-S6K信號通路14-16
• 1.3 骨骼肌的病理研究16
• 1.4 骨骼肌發(fā)育相關(guān)基因MBNL研究進展16-19
• 第二章 MicroRNA （mi RNA）研究進展19-25
• 2.1 mi RNA的表達19
• 2.2 mi RNA的轉(zhuǎn)錄19-20
• 2.3 mi RNA的成熟20-21
• 2.4 RISC的裝配21
• 2.5 mRNA的降解和蛋白質(zhì)翻譯過程的抑制21-22
• 2.6 mi RNA對肌肉發(fā)育的影響22
• 2.7 mi RNA的定量檢測22-23
• 2.8 miR-30的研究進展23-24
• 本研究的目的意義24-25
• 實驗部分25-65
• 第三章 miR305p表達譜的研究25-32
• 3.1 實驗材料25
• 3.2 實驗儀器與設(shè)備25
• 3.3 試劑及試劑盒25
• 3.4 實驗方法25-26
• 3.4.1 miR305p的生物信息學(xué)分析25
• 3.4.2 miR305p在胎牛、犢牛和成年牛各組織中的表達25-26
• 3.5 結(jié)果與分析26-30
• 3.5.1 miR305p的生物信息學(xué)分析26-28
• 3.5.1.1 1miR-30-5pp在基因組組位置分析26-27
• 3.5.1.2 miR305p各成員間保守性分析27
• 3.5.1.3 miR305p物種間保守性分析27-28
• 3.5.2 miR305p的表達譜研究28-30
• 3.6 討論30-31
• 3.7 小結(jié)31-32
• 第四章 miR305p對骨骼肌肌肉分化的影響32-40
• 4.1 實驗材料32
• 4.2 實驗儀器與設(shè)備32
• 4.3 試劑及試劑盒32
• 4.4 實驗方法32-36
• 4.4.1 構(gòu)建mi R305p過表達載體32-34
• 4.4.2 miR305p前體PCDNA3.1（+）載體構(gòu)建34-35
• 4.4.3 miR305p對肌肉分化影響的研究35-36
• 4.5 結(jié)果與分析36-39
• 4.5.1 pre-miR305p過表達載體pcDNA3.1（+）的構(gòu)建36-38
• 4.5.2 miR305p過表達載體表達成熟miRNA能力的檢測38
• 4.5.3 miR305p對肌肉分化的影響38-39
• 4.6 討論39
• 4.7 小結(jié)39-40
• 第五章 miR305p直接靶向MBNL40-61
• 5.1 實驗材料40
• 5.2 實驗儀器與設(shè)備40
• 5.3 試劑及試劑盒40
• 5.4 實驗方法40-46
• 5.4.1 miR305p與MBNL表達量的相關(guān)關(guān)系40
• 5.4.2 雙熒光素酶實驗40-44
• 5.4.3 MBNL基因mRNA及蛋白的表達量：44-45
• 5.4.4 MBNL1促進肌肉分化45-46
• 5.5 結(jié)果與分析46-58
• 5.5.1 miR305p與MBNL表達量的相關(guān)關(guān)系46-49
• 5.5.2 MBNL 3’UTR的雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建49-50
• 5.5.3 MBNL3’UTR突變型熒光報告載體載體構(gòu)建50-52
• 5.5.4 miR305p直接靶向MBNL152-54
• 5.5.5 miR305p直接靶向MBNL254-56
• 5.5.6 miR305p直接靶向MBNL356-57
• 5.5.7 MBNL1促進肌肉分化57-58
• 5.6 討論58-60
• 5.7 小結(jié)60-61
• 第六章 miR305p調(diào)節(jié)INSR和Trim55的可變剪切61-65
• 6.1 實驗材料61
• 6.2 實驗儀器與設(shè)備61
• 6.3 試劑及試劑盒61
• 6.4 實驗方法61-62
• 6.4.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染61
• 6.4.2 定量檢測INSR和Trim55的mRNA表達量61-62
• 6.5 結(jié)果與分析62-63
• 6.6 討論63-64
• 6.7 小結(jié)64-65
• 結(jié)論與創(chuàng)新點65-66
• 結(jié)論65
• 創(chuàng)新點65-66
• 參考文獻66-74
• 附錄74-81
• 致謝81-82
• 作者簡介82

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10 ;[J];;年期

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1 白躍宏;歐陽頎;楊遠濱;張龍海;劉樹清;;慢性骨筋膜室綜合征動物模型的建立及骨骼肌病理變化的實驗研究[A];全國軟組織疼痛微創(chuàng)技術(shù)專題研討會論文匯編[C];2004年

2 張學(xué)林;高曉娟;史冀鵬;王瑞元;;骨骼肌超微結(jié)構(gòu)損傷累積與過勞性損傷關(guān)系的研究[A];2011年中國生理學(xué)會運動生理學(xué)專業(yè)委員會會議暨“運動與骨骼肌”學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2011年

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4 劉健;黃梅;;Ⅱ型糖原蓄積病患者骨骼肌的超微結(jié)構(gòu)觀察[A];第八次全國電子顯微學(xué)會議論文摘要集（Ⅰ）[C];1994年

5 白躍宏;歐陽頎;楊遠濱;張龍海;劉樹清;;慢性骨筋膜室綜合征動物模型的建立及骨骼肌病理變化的實驗研究[A];第九屆全國軟組織疼痛學(xué)術(shù)會議暨首屆中華醫(yī)學(xué)會疼痛學(xué)會軟組織疼痛年會論文匯編[C];2004年

6 任振義;葉健;;COPD過氧化應(yīng)激所致的骨骼肌功能障礙[A];2006年浙江省呼吸系病學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2006年

7 宋淑華;熊開宇;;離子濃度改變對骨骼肌膜電位和骨骼肌疲勞的研究進展[A];2007全國運動生理學(xué)論文報告會論文集[C];2007年

8 任振義;;COPD過氧化應(yīng)激所致的骨骼肌功能障礙[A];浙江省中西醫(yī)結(jié)合呼吸病診治進展暨第五次學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2006年

9 賴顥;趙強;虞勇;王克強;;體外共同培養(yǎng)的鼠骨骼肌成肌細胞與心肌細胞間連接的形態(tài)研究[A];第八屆華東六省一市胸心血管外科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

10 蘇冠華;劉啟云;盧永昕;米少華;孫雨霏;劉曉明;帥欣欣;;犬骨骼肌成肌細胞體外分離、純化及培養(yǎng)方法改良探索[A];中華醫(yī)學(xué)會第11次心血管病學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

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8 彭保衛(wèi);電脈沖介導(dǎo)的DNA疫苗骨骼肌內(nèi)免疫接種的轉(zhuǎn)基因長期表達和抗原遞呈機理的研究[D];上海交通大學(xué);2006年

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1 田鐵英;機械通氣對COPD患者骨骼肌基因及泛素系統(tǒng)相關(guān)蛋白表達的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

2 程小芳;低蛋白日糧平衡氨基酸對斷奶仔豬骨骼肌生長相關(guān)蛋白質(zhì)表達規(guī)律的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 秦庚;長非編碼RNA Rian/Irm在骨骼肌發(fā)育中的功能初步研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2015年

4 賈青;脂聯(lián)素調(diào)控肉雞骨骼肌脂肪代謝的機制研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 朱曉翠;PKC和Rab GTPase在鈣信號調(diào)節(jié)骨骼肌細胞GLUT4胞內(nèi)運輸機制中的作用[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

6 孟慶敏;Ⅱ型HDAC5對大鼠骨骼肌GLUT4蛋白表達影響的研究[D];成都體育學(xué)院;2015年

7 祁翔;亮氨酸補充對老齡大鼠骨骼肌生長的影響及機理探討[D];上海體育學(xué)院;2015年

8 李喜鳳;住院老年患者骨骼肌減少與骨密度的關(guān)系[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

9 譚婭;豬心肌和骨骼肌microRNA表達譜分析與比較[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

10 張博文;牛miR-30-5p在骨骼肌中的表達與功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

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