藍舌病(Bluetongue, BT)是由呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬藍舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)引起的,主要感染綿羊,山羊,牛和鹿等反芻動物的非接觸性傳染病。該病經(jīng)媒介昆蟲(庫蠓,伊蚊等)傳播,可以引起病畜高熱,過度流涎,面部和舌頭腫脹以及舌頭發(fā)紺等。到目前為止,世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)26種BTV血清型。由于抗原變異以及各個血清型之間有限的免疫交叉保護力,這給BTV的免疫預(yù)防帶來了極大地困難。因此,群特異性或型特異性表位疫苗的發(fā)展對BTV的防治具有重要的意義。 本研究首先對GenBank中各個地理分離株BTV4的S6序列進行比對,根據(jù)非編碼區(qū)的保守性序列設(shè)計反轉(zhuǎn)錄引物。然后從BTV4感染的BHK-21細胞中提取基因組dsRNA,對VP5蛋白的目的基因進行RT-PCR,連接至pEASY-Blunt載體,并對其測序。根據(jù)測序結(jié)果,分別設(shè)計上下游引物,對VP5目的基因的編碼區(qū)進行PCR,經(jīng)雙酶切后連接至原核表達載體pMALTM-c4x和Bac-to-Bac真核表達載體pFastBacTMHTA,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMAL-VP5和pFast-VP5.將重組質(zhì)粒pFast-VP5轉(zhuǎn)化...

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖2.1BTV4dsRNA的提取以及S6的克隆Fig.2.1.ExtrationofdsRNA，andcloningofBTV4segment6encodingtheVPSprotein.Leftpanel(lane1):GenomicdsRNAextractedfromBTV4-infectedBHK-21cellswasrunon9%

圖2.1BTV4dsRNA的提取以及S6的克隆Fig.2.1.ExtrationofdsRNA，andcloningofBTV4segment6encodingtheVPSprotein.Leftpanel(lane1):Genomicds....

圖2.2重組質(zhì)粒pMAL-VP5的雙酶切和PCR鑒定Fig,2.2IdentificationofrecombinantplasmidpMAL-VP5byrestrictedenzymedigestionandPCRLeftpanel(lane1);pMAL-VP5digestedbyEcoRIandPst1;

雙酶切后電泳鑒定大小分別為6600bp和1600bp，與預(yù)期結(jié)果相符。電泳鑒定PCR產(chǎn)物，結(jié)果與預(yù)期相符，在1600bp有特異條帶（圖2.2)。M1 M2■■2000bp1000bp1000bp■■圖2.2重組質(zhì)粒pMAL-VP5的雙酶切和PCR鑒定Fig,2.2....

圖2.3SDS-PAGE和Westernbk)t鑒定原核表達與純化的重合蛋白VP5Fig.2.3.AnalysisofprokaryoticallyexpressedandpurifiedproteinVP5bySDS-PAGEandWesternblot

圖2.3SDS-PAGE和Westernbk)t鑒定原核表達與純化的重合蛋白VP5Fig.2.3.AnalysisofprokaryoticallyexpressedandpurifiedproteinVP5bySDS-PAGEandWesternb....

圖3.1重組質(zhì)粒pFast-VP5雙_切鑒定

提取質(zhì)粒pFast-VP5，對其進行雙酶切,用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小分別為4900bp與1500bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符（圖3.1)。M1H[5000bpbp 5000bp^H|H2000bp 3000bpmm1500bp翻bp ？50ssH1000b....

本文編號：3984853