Stathmin蛋白是一種微管解聚蛋白,主要通過磷酸化程度來調節(jié)自身的活性從而改變微管系統的動力平衡,進而參與調節(jié)細胞的增殖分化。研究表明STMN1基因在快速增殖分化的細胞中表達量高,在正常的組織細胞中基本不表達,在豬胚胎發(fā)育前期的肌肉組織中表達量高。本實驗通過生物信息學對豬STMN1基因進行分析預測；克隆不同豬種STMN1基因的啟動子和3’UTR區(qū)域；構建真核表達載體pcDNA3.1-STMN1和合成干擾小分子siRNA-STMN1轉染C2C12細胞來上調/下調STMN1基因在C2C12細胞中的表達、利用熒光定量PCR及Western blot等試驗方法來驗證STMN1基因對C2C12細胞的增殖分化功能的影響。研究結果如下： 1.利用生物信息學的方法對豬STMN1基因結構進行分析,預測得到豬STMN1基因近端啟動子區(qū)域位于+817bp至+1066bp處,同時預測得到豬STMN1基因近端啟動子區(qū)域具有MyoD、GATA-1、HSF2等轉錄因子結合位點和1個大小1000bp左右的CpG島。對不同物種STMN1基因表達的蛋白序列比對,發(fā)現Stathmin蛋白具有高度保守性。 2.擴增通城豬...

【文章頁數】：80 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表
1 文獻綜述
    1.1 肌肉的生長發(fā)育
        1.1.1 肌細胞發(fā)育相關的基因
        1.1.2 肌細胞生長相關研究進展
    1.2 STMN1基因概述及其功能研究
        1.2.1 STMN1基因的結構
        1.2.2 STMN1基因與細胞周期
        1.2.3 STMN1基因的功能
    1.3 研究目的與意義
2 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 試驗樣品與細胞及載體
        2.1.2 主要試劑與試劑盒
        2.1.3 主要試劑和緩沖液配制
        2.1.4 主要儀器設備
        2.1.5 分子生物學軟件與生物信息學網站
    2.2 試驗方法
        2.2.1 豬STMN1基因近端啟動子生物信息學分析
        2.2.2 豬STMN1基因的克隆及SNPs尋找
        2.2.3 真核表達載體pcDNA3.1-STMN1的構建
        2.2.4 干擾片段的設計與合成
        2.2.5 細胞分化實驗
        2.2.6 細胞增殖實驗
        2.2.7 Western Blot檢測STMN1基因對C2C12細胞影響后Ki67蛋白的表達量
        2.2.8 統計分析方法
3 結果與分析
    3.1 生物信息學分析STMN1基因
        3.1.1 生物信息學對STMN1基因近端啟動子區(qū)域預測
        3.1.2 生物信息學對STMN1基因近端啟動子區(qū)域CpG島預測
        3.1.3 生物信息學分析STMN1基因在不同物種中的親緣關系
    3.2 對豬STMN1基因啟動子和3'UTR區(qū)域的克隆及SNPs尋找
        3.2.1 克隆不同豬種STMN1基因啟動子區(qū)域
        3.2.2 克隆不同豬種STMN1基因3'UTR區(qū)域
        3.2.3 對不同豬種STMN1基因的啟動子及3'UTR區(qū)域的SNPs尋找
    3.3 真核表達載體pcDNA3.1-STMN1的構建與干擾片段的合成
        3.3.1 豬肌肉組織RNA的提取
        3.3.2 豬STMN1基因的CDs擴增及真核表達載體pcDNA3.1-STMN1雙酶切鑒定
        3.3.3 干擾片段siRNA的篩選
    3.4 豬STMN1基因對C2C12細胞的分化作用
        3.4.1 C2C12細胞不同時期的分化效果
        3.4.2 C2C12細胞的轉染效率分析
        3.4.3 豬STMN1基因對C2C12細胞分化的影響
    3.5 豬STMN1基因對C2C12細胞增殖的影響
        3.5.1 羅氏ARCE儀器實時檢測上調/下調STMN1基因表達后C2C12細胞數目
        3.5.2 上調/下調STMN1基因對細胞增殖影響數據分析結果
        3.5.3 Western blot檢測上調/下調STMN1基因的表達對C2C12細胞增殖的影響
4 討論
    4.1 實驗設計
    4.2 試驗方法
        4.2.1 細胞轉染方法的選擇與改進
        4.2.2 實驗儀器的選擇
    4.3 豬STMN1基因啟動子區(qū)域潛在SNPs的可靠性
    4.4 轉染后的效果分析
    4.5 豬STMN1基因對C2C12細胞分化的作用
    4.6 豬STMN1基因對C2C12細胞增殖的影響
    4.7 后續(xù)的工作計劃
結論
參考文獻
附錄一
附錄二
致謝



本文編號：3984522