水牛是重要的肉役兩用家畜,人們對水牛性狀的改良一直都在研究。CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展讓快速、高效地改良水牛性狀成為可能。研究表明MSTN(肌肉生長抑制素)基因?qū)趋兰∩L有調(diào)控作用。本研究在CRISPR/Cas9系統(tǒng)基礎(chǔ)上設計了一種電穿孔工具和多條規(guī)則性gRNA,結(jié)合電穿孔技術(shù)將Cas9蛋白和多條規(guī)則性gRNA導入水牛受精卵對MSTN基因進行敲除。研究結(jié)果具體如下:1.水牛受精卵電穿孔參數(shù)的確定通過電穿孔技術(shù)將EGFP mRNA導入水牛受精卵,根據(jù)受精卵熒光陽性率和隨后胚胎的發(fā)育情況探討最佳電穿孔參數(shù)。當脈沖時間(2ms)、脈沖次數(shù)(3次)、脈沖時間間隔(0.2s)一定時,脈沖電壓為30V組胚胎的囊胚發(fā)育率均顯著高于40V和50V組,胚胎熒光陽性率低于40V組但高于50V組(P<0.05)。當脈沖電壓(30v)、脈沖次數(shù)(4次)、脈沖時間間隔(0.2s)一定時,脈沖時間為4ms組的胚胎熒光陽性率顯著高于2ms組(P<0.05),但囊胚率差異不顯著(P>0.05);當電脈沖時間為6ms時對受精卵損傷較大。當脈沖電壓(30v)、脈沖時間(4ms)、脈沖時間間隔(0...

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１?ＺＦＮ的基本結(jié)構(gòu)??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｔｈｅ?ｓｔｕｒｅｃｔｕｒｅ?ｏｆ?Ｚｉｎｃ?Ｆｉｎｇｅｒ??

Ｍｏｄｉｆｉｅｄ?ｆｒｏｍ?Ｐｏｒｔｏｕｓ?ａｎｄ?Ｃａｒｒｏｌｌ?（２００５）?Ｎａｔ??Ｂｉｏｔｅｃｈ?２３：９６７－９７３??圖１－２?ＺＦＮ的定點切割ＤＮＡ??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｔｈｅ?ｓｔｕｒｅｃｔｕｒｅ?ｏｆ?Ｚｉｎｃ?Ｆｉｎｇｅｒ?ｓｈｅａｒｓ?ＤＮＡ??１．３....

圖１－３?ＴＡＬＥＮ的的結(jié)構(gòu)??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３?Ｔｈｅ?ｓｔｕｒｅｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＴＡＬＥＮ??

重復可變雙殘基，ＲＶＤ，棍狀顯示）來識別一個單一的堿基對。ＴＡＬＥＮ目標位點由兩??個ＴＡＬＥ結(jié)合位點組成，這兩個位點間通過不同長度的間隔區(qū)序列（１２－２０ｂｐ）分開。??ＴＡＬＥ可以被設計成僅僅識別左半側(cè)位點或右半側(cè)位點（圖１－３）。??１?＾?＾８??＿??錄?１２賴??我ｔ....

圖１－４?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的的結(jié)構(gòu)??Ｆｉｇｕｒｅ?１－４?Ｔｈｅ?ｓｔｕｒｅｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９??

結(jié)合后引導Ｃａｓ９蛋白對目的ＤＮＡ片段５＇－２０ｎｔ－ＮＧＧ或５＇－ＣＣＮ－２０ｎｔ位置進行隨??機切割［３７，?３８］。ＰＡＭ的ＮＧＧ位點在生物體基因組中大量分布，因此在不同目的打靶基??因中設計ｇＲＮＡ還是比較容易。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９具體結(jié)構(gòu)如圖１－４。??＾?．??⑥茂....

圖１－６體細胞核移植與電穿孔ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９效率比較??Ｆｉｇｕｒｅ?１－６?Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＳＣＮＴ?ａｎｄ?ｔｈｅ?ＧＥＥＰ?ｍｅｔｈｏｄ??

出了一個較好的解決方案。２０１６年Ｆｕｍｉｎｏｒｉ?Ｔａｎｉｈａｒａ等繼續(xù)優(yōu)化這種方法運用在豬胚??胎上進行基因編輯，發(fā)現(xiàn)整個過程可以在１０鐘完成，相比于傳統(tǒng)的體細胞核移植育種??技術(shù)大大縮短了工作時間和工作流程［７３］，顯示出非常高的基因敲除工作效率（圖１－６）。??？?１３?....

本文編號：3984222