豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),為單股正鏈RNA病毒,基因組長(zhǎng)度約為12.3 kb,編碼12種病毒蛋白。微小RNA(miRNAs)是存在于多種生物細(xì)胞內(nèi)的非編碼單鏈RNA,長(zhǎng)度大約為22個(gè)核苷酸(Nucleotide,nt),主要具有RNA剪切以及基因轉(zhuǎn)錄前調(diào)控等功能。MiRNAs主要通過(guò)靶標(biāo)目的基因的3’非編碼區(qū)(3’untranslated regions,3’UTR)起作用,當(dāng)miRNAs的種子序列與靶標(biāo)基因序列完全互補(bǔ)時(shí)降解靶基因,而當(dāng)不完全互補(bǔ)時(shí)通過(guò)抑制靶基因翻譯的方式發(fā)揮作用。我們對(duì)CSFV感染的豬臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Swine umbilical vein endothelial cells,SUVEC)通過(guò)基因組高通量測(cè)序,進(jìn)行差異miRNAs篩選。發(fā)現(xiàn)在CSFV感染后SUVEC中有8個(gè)顯著上調(diào)和4個(gè)下調(diào)顯著的miRNAs,但這些miRNAs在CSFV感染中的作用尚缺少研究。通過(guò)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),在CSFV和SUVEC中均存在miR-140調(diào)控的靶標(biāo)基因,對(duì)SUVEC中受miR-140調(diào)控靶標(biāo)基因的鑒定、miR-140靶標(biāo)蛋白與CS...

【文章頁(yè)數(shù)】：78 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號(hào)對(duì)照表
文獻(xiàn)綜述
    第一章 豬瘟病毒及miRNAs的研究進(jìn)展
        1.1 豬瘟病毒的研究進(jìn)展
            1.1.1 豬瘟病毒的復(fù)制增殖
            1.1.2 豬瘟病毒基因組及編碼蛋白的作用
            1.1.3 豬瘟病毒基因分型和主要毒力因子
            1.1.4 豬瘟病毒的致病機(jī)理
            1.1.5 豬瘟的診斷及防控
        1.2 miRNA的研究進(jìn)展
            1.2.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)
            1.2.2 miRNA的加工
            1.2.3 miRNA的進(jìn)化
            1.2.4 miRNA對(duì)細(xì)胞功能的影響
            1.2.5 宿主miRNA與病毒感染
            1.2.6 病毒miRNAs(v-miRNAs)
            1.2.7 豬瘟病毒感染細(xì)胞的miRNAs
        1.3 本研究的目的和意義
試驗(yàn)研究
    第二章 miR-140對(duì)CSFV復(fù)制的影響
        2.1 材料
            2.1.1 病毒、細(xì)胞、血清和主要試劑
            2.1.2 主要儀器設(shè)備
        2.2 方法
            2.2.1 miR-140 模擬物、抑制劑的設(shè)計(jì)與合成及定量引物
            2.2.2 絕對(duì)熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
            2.2.3 豬瘟病毒復(fù)制曲線的建立
            2.2.4 豬瘟病毒感染細(xì)胞后miR-140 的檢測(cè)
            2.2.5 miR-140 mimics對(duì) CSFV復(fù)制的影響
            2.2.6 miR-140 inhibitors對(duì) CSFV復(fù)制的影響
        2.3 結(jié)果
            2.3.1 絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
            2.3.2 豬瘟病毒復(fù)制曲線的建立
            2.3.3 豬瘟病毒感染細(xì)胞miR-140 檢測(cè)
            2.3.4 miR-140 mimics對(duì)豬瘟病毒復(fù)制的影響
            2.3.5 miR-140 inhibitors對(duì)豬瘟病毒復(fù)制的影響
        2.4 討論
        2.5 小結(jié)
    第三章 豬臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中miR-140 預(yù)測(cè)靶標(biāo)基因Rab25 的鑒定
        3.1 材料
            3.1.1 細(xì)胞、病毒、血清及主要試劑
            3.1.2 主要儀器設(shè)備
        3.2 方法
            3.2.1 miR-140 靶向豬臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞靶基因的預(yù)測(cè)
            3.2.2 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)miR-140與Rab25 基因的靶標(biāo)關(guān)系
            3.2.3 miR-140對(duì)Rab25 影響的RT-qPCR檢測(cè)
            3.2.4 miR-140對(duì)Rab25 影響的Western blot檢測(cè)
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 預(yù)測(cè)miR-140 靶向豬臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的靶標(biāo)基因
            3.3.2 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)miR-140與Rab25 基因的結(jié)合
            3.3.3 miR-140對(duì)Rab25 核酸表達(dá)的影響
            3.3.4 miR-140對(duì)Rab25 蛋白表達(dá)的影響
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第四章 Rab25對(duì)CSFV復(fù)制影響及與NS2、NS3、NS5A蛋白共定位研究
        4.1 材料
            4.1.1 細(xì)胞、病毒、血清及主要試劑
            4.1.2 主要儀器設(shè)備
        4.2 方法
            4.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成
            4.2.2 Rab25 干擾、表達(dá)載體及NS5A分段表達(dá)載體的構(gòu)建
            4.2.3 Rab25對(duì)CSFV復(fù)制的影響
            4.2.4 豬瘟病毒感染對(duì)miR-140及Rab25 的影響
            4.2.5 Rab25與NS2、NS3、NS5A的細(xì)胞定位觀察
            4.2.6 Rab25與NS5A基因片段表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞共定位觀察
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
            4.3.2 Rab25 對(duì)豬瘟病毒復(fù)制的影響
            4.3.3 CSFV感染細(xì)胞對(duì)miR-140和Rab25 的影響
            4.3.4 Rab25與NS5A蛋白細(xì)胞定位觀察
            4.3.5 Rab25與NS5A基因片段表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞定位觀察
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3983836