發(fā)布時間：2024-05-29 00:40

　　豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),為單股正鏈RNA病毒,基因組長度約為12.3 kb,編碼12種病毒蛋白。微小RNA(miRNAs)是存在于多種生物細胞內(nèi)的非編碼單鏈RNA,長度大約為22個核苷酸(Nucleotide,nt),主要具有RNA剪切以及基因轉(zhuǎn)錄前調(diào)控等功能。MiRNAs主要通過靶標目的基因的3’非編碼區(qū)(3’untranslated regions,3’UTR)起作用,當(dāng)miRNAs的種子序列與靶標基因序列完全互補時降解靶基因,而當(dāng)不完全互補時通過抑制靶基因翻譯的方式發(fā)揮作用。我們對CSFV感染的豬臍靜脈內(nèi)皮細胞(Swine umbilical vein endothelial cells,SUVEC)通過基因組高通量測序,進行差異miRNAs篩選。發(fā)現(xiàn)在CSFV感染后SUVEC中有8個顯著上調(diào)和4個下調(diào)顯著的miRNAs,但這些miRNAs在CSFV感染中的作用尚缺少研究。通過軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn),在CSFV和SUVEC中均存在miR-140調(diào)控的靶標基因,對SUVEC中受miR-140調(diào)控靶標基因的鑒定、miR-140靶標蛋白與CS...

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號對照表
文獻綜述
    第一章 豬瘟病毒及miRNAs的研究進展
        1.1 豬瘟病毒的研究進展
            1.1.1 豬瘟病毒的復(fù)制增殖
            1.1.2 豬瘟病毒基因組及編碼蛋白的作用
            1.1.3 豬瘟病毒基因分型和主要毒力因子
            1.1.4 豬瘟病毒的致病機理
            1.1.5 豬瘟的診斷及防控
        1.2 miRNA的研究進展
            1.2.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)
            1.2.2 miRNA的加工
            1.2.3 miRNA的進化
            1.2.4 miRNA對細胞功能的影響
            1.2.5 宿主miRNA與病毒感染
            1.2.6 病毒miRNAs(v-miRNAs)
            1.2.7 豬瘟病毒感染細胞的miRNAs
        1.3 本研究的目的和意義
試驗研究
    第二章 miR-140對CSFV復(fù)制的影響
        2.1 材料
            2.1.1 病毒、細胞、血清和主要試劑
            2.1.2 主要儀器設(shè)備
        2.2 方法
            2.2.1 miR-140 模擬物、抑制劑的設(shè)計與合成及定量引物
            2.2.2 絕對熒光定量標準曲線的建立
            2.2.3 豬瘟病毒復(fù)制曲線的建立
            2.2.4 豬瘟病毒感染細胞后miR-140 的檢測
            2.2.5 miR-140 mimics對 CSFV復(fù)制的影響
            2.2.6 miR-140 inhibitors對 CSFV復(fù)制的影響
        2.3 結(jié)果
            2.3.1 絕對定量標準曲線的建立
            2.3.2 豬瘟病毒復(fù)制曲線的建立
            2.3.3 豬瘟病毒感染細胞miR-140 檢測
            2.3.4 miR-140 mimics對豬瘟病毒復(fù)制的影響
            2.3.5 miR-140 inhibitors對豬瘟病毒復(fù)制的影響
        2.4 討論
        2.5 小結(jié)
    第三章 豬臍靜脈內(nèi)皮細胞中miR-140 預(yù)測靶標基因Rab25 的鑒定
        3.1 材料
            3.1.1 細胞、病毒、血清及主要試劑
            3.1.2 主要儀器設(shè)備
        3.2 方法
            3.2.1 miR-140 靶向豬臍靜脈內(nèi)皮細胞靶基因的預(yù)測
            3.2.2 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-140與Rab25 基因的靶標關(guān)系
            3.2.3 miR-140對Rab25 影響的RT-qPCR檢測
            3.2.4 miR-140對Rab25 影響的Western blot檢測
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 預(yù)測miR-140 靶向豬臍靜脈內(nèi)皮細胞中的靶標基因
            3.3.2 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-140與Rab25 基因的結(jié)合
            3.3.3 miR-140對Rab25 核酸表達的影響
            3.3.4 miR-140對Rab25 蛋白表達的影響
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第四章 Rab25對CSFV復(fù)制影響及與NS2、NS3、NS5A蛋白共定位研究
        4.1 材料
            4.1.1 細胞、病毒、血清及主要試劑
            4.1.2 主要儀器設(shè)備
        4.2 方法
            4.2.1 引物設(shè)計與合成
            4.2.2 Rab25 干擾、表達載體及NS5A分段表達載體的構(gòu)建
            4.2.3 Rab25對CSFV復(fù)制的影響
            4.2.4 豬瘟病毒感染對miR-140及Rab25 的影響
            4.2.5 Rab25與NS2、NS3、NS5A的細胞定位觀察
            4.2.6 Rab25與NS5A基因片段表達產(chǎn)物的細胞共定位觀察
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
            4.3.2 Rab25 對豬瘟病毒復(fù)制的影響
            4.3.3 CSFV感染細胞對miR-140和Rab25 的影響
            4.3.4 Rab25與NS5A蛋白細胞定位觀察
            4.3.5 Rab25與NS5A基因片段表達產(chǎn)物的細胞定位觀察
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡介



本文編號：3983836