發(fā)布時(shí)間：2024-05-25 05:28

　　山羊乳中總脂肪含量,尤其是其中與人類健康密切相關(guān)的中短鏈脂肪酸及不飽和脂肪酸含量均高于牛乳。山羊乳的乳脂特點(diǎn)應(yīng)與其乳腺乳脂代謝密切相關(guān)。然而,在乳脂代謝基因中,至今尚未發(fā)現(xiàn)山羊特異性表達(dá)或者具有特異功能的基因。據(jù)此推測山羊乳脂代謝的特點(diǎn)可能與其在基因不同水平(如轉(zhuǎn)錄后、翻譯水平)的調(diào)控機(jī)制有關(guān)。MicroRNAs (miRNAs)是一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的小分子RNA,其功能幾乎涉及生命活動(dòng)的各個(gè)方面。已證實(shí)miRNAs是調(diào)控脂肪和肝臟組織中脂肪代謝的重要因子,然而,現(xiàn)有研究缺乏(?)niRNAs調(diào)控山羊乳腺乳脂代謝的研究報(bào)道。因此,本研究從miRNAs調(diào)控乳腺乳脂代謝的角度出發(fā),通過測序技術(shù)獲得西農(nóng)薩能奶山羊乳腺組織miRNAs表達(dá)譜,分析其序列特征,檢測其在乳腺組織不同階段的表達(dá)水平,篩選與山羊乳脂代謝相關(guān)的miRNAs,并通過在山羊乳腺上皮細(xì)胞(GMEC)中過表達(dá)miRNAs,檢測細(xì)胞中與乳脂代謝相關(guān)的指標(biāo),證實(shí)miRNAs對山羊乳脂合成和組成具有重要影響,同時(shí)發(fā)現(xiàn)3對可在乳腺組織中協(xié)同表達(dá)的miRNAs,發(fā)現(xiàn)其協(xié)同調(diào)控山羊乳腺組織乳脂代謝。本研究從miRNAs調(diào)控角度闡明...

【文章頁數(shù)】：140 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 動(dòng)物microRNAs(miRNAs)的生物學(xué)特征
        1.1.1 MiRNAs的生成
        1.1.2 MiRNAs的序列及功能特點(diǎn)
        1.1.3 MiRNAs調(diào)控下游基因表達(dá)的原理
        1.1.4 調(diào)控miRNAs表達(dá)的分子機(jī)制
    1.2 MiRNAs在動(dòng)物生長、發(fā)育中的功能
        1.2.1 MiRNAs調(diào)控個(gè)體發(fā)育的功能
        1.2.2 MiRNAs調(diào)控哺乳動(dòng)物組織發(fā)育的功能
        1.2.3 MiRNAs對乳腺發(fā)育的調(diào)控作用
    1.3 MiRNAs對脂質(zhì)代謝的調(diào)控作用
        1.3.1 MiRNAs調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝
        1.3.2 MiRNAs調(diào)控脂肪組織和細(xì)胞中的脂肪代謝
        1.3.3 MiRNAs調(diào)控其它組織和細(xì)胞中的脂質(zhì)代謝
    1.4 乳腺組織乳脂代謝分子機(jī)制
        1.4.1 乳脂肪與其它組織中脂肪的區(qū)別
        1.4.2 山羊乳脂肪的組成特點(diǎn)及功能
        1.4.3 牛和小鼠乳腺組織乳脂代謝分子機(jī)制
        1.4.4 山羊乳脂代謝分子機(jī)制研究進(jìn)展
    1.5 MiRNAs調(diào)控乳腺乳脂代謝分子機(jī)制研究進(jìn)展
    1.6 本研究的目的意義
第二章 山羊乳腺組織miRNAs測序、生物信息學(xué)分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 主要試劑和儀器
        2.1.2 動(dòng)物樣品采集、總RNA提取
        2.1.3 Solexa測序
        2.1.4 山羊乳腺組織miRNAs的生物信息學(xué)鑒定
        2.1.5 山羊miRNAs特征分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 總RNA樣品檢測結(jié)果
        2.2.2 Solexa測序結(jié)果質(zhì)量鑒定及小RNAs序列分析
        2.2.3 山羊乳腺組織miRNAs序列分析
    2.3 討論
        2.3.1 Solexa測序結(jié)果的質(zhì)量
        2.3.2 山羊乳腺組織小RNAs長度分布與功能
        2.3.3 山羊miRNAs序列的生物信息學(xué)鑒定方法
        2.3.4 山羊保守miRNAs的序列特征
    2.4 小結(jié)
第三章 泌乳中期和干奶期山羊乳腺組織差異表達(dá)miRNAs的篩選及功能預(yù)測
    3.1 材料與方法
        3.1.1 主要試劑和儀器
        3.1.2 動(dòng)物樣品采集及總RNA提取
        3.1.3 MiRNA cDNA合成與定量PCR
        3.1.4 MiRNAs靶基因預(yù)測、GO富集和KEGG通路分析
        3.1.5 山羊乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.1.6 催乳素試驗(yàn)及細(xì)胞總RNA提取
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 山羊乳腺組織泌乳中期和干奶期miRNAs表達(dá)分析
        3.2.2 差異表達(dá)miRNAs靶基因的功能預(yù)測
        3.2.3 調(diào)控山羊乳脂代謝miRNAs的篩選
    3.3 討論
        3.3.1 MiRNAs在不同動(dòng)物乳腺組織中的表達(dá)情況
        3.3.2 MiRNAs對乳腺發(fā)育和脂肪代謝的調(diào)控作用
        3.3.3 激素對miRNAs表達(dá)的調(diào)節(jié)作用
    3.4 小結(jié)
第四章 腺病毒介導(dǎo)的miRNAs在乳腺上皮細(xì)胞中的過表達(dá)研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 腺病毒載體構(gòu)建所用試劑、材料和儀器
        4.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑、材料和儀器
        4.1.3 腺病毒載體構(gòu)建
        4.1.4 腺病毒載體pAd-miRNAs在HEK293細(xì)胞株中的包裝和擴(kuò)繁
        4.1.5 病毒感染乳腺上皮細(xì)胞
        4.1.6 細(xì)胞核染色
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 重組腺病毒質(zhì)粒pAd-miRNAs的構(gòu)建及鑒定
        4.2.2 pAd-miRNA包裝和病毒擴(kuò)繁
        4.2.3 腺病毒介導(dǎo)miRNAs在GMEC中的過表達(dá)
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
第五章 MiR-103對山羊乳腺上皮細(xì)胞乳脂代謝的調(diào)控作用研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 主要試劑和儀器
        5.1.2 動(dòng)物樣品采集、總RNA提取
        5.1.3 CDNA合成及定量PCR
        5.1.4 脂滴油紅O染色
        5.1.5 甘油三酯提取、含量測定
        5.1.6 脂肪酸提取、含量測定
        5.1.7 MiRNA inhibitor轉(zhuǎn)染乳腺上皮細(xì)胞
        5.1.8 相關(guān)性分析
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 細(xì)胞中脂滴形態(tài)觀察結(jié)果
        5.2.2 甘油三酯含量測定結(jié)果
        5.2.3 脂肪酸含量分析結(jié)果
        5.2.4 乳脂生成相關(guān)基因mRNAs檢測結(jié)果
        5.2.5 其它乳脂代謝相關(guān)基因表達(dá)量檢測結(jié)果
        5.2.6 MiR-103表達(dá)量抑制試驗(yàn)
        5.2.7 MiR-1031與泛酸酶基因(PANK3)表達(dá)量的關(guān)聯(lián)分析
    5.3 討論
        5.3.1 研究miR-103調(diào)控乳脂合成功能的重要性
        5.3.2 MiR-103對脂肪脂解、β-氧化的調(diào)控作用
        5.3.3 MiR-103-1與PANK3
    5.4 小結(jié)
第六章 MiR-27a對山羊乳腺上皮細(xì)胞乳脂代謝的調(diào)控作用研究
    6.1 材料與方法
        6.1.1 主要試劑和儀器
        6.1.2 細(xì)胞總RNA提取、cDNA合成和定量PCR試驗(yàn)
        6.1.3 油紅O染色、甘油三酯含量測定及脂肪酸提取
        6.1.4 Western blotting
    6.2 結(jié)果
        6.2.1 細(xì)胞中脂滴形態(tài)觀察結(jié)果
        6.2.2 甘油三酯含量測定結(jié)果
        6.2.3 脂肪酸含量分析結(jié)果
        6.2.4 乳脂合成相關(guān)基因mRNAs定量檢測結(jié)果
        6.2.5 PPARγ表達(dá)量檢測結(jié)果
        6.2.6 脂肪分解和β-氧化相關(guān)基因表達(dá)量檢測結(jié)果
    6.3 討論
        6.3.1 MiR-27a對GMEC乳脂代謝的調(diào)控作用
        6.3.2 過表達(dá)miR-27a對不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比例的影響
        6.3.3 PPARγ對下游基因的調(diào)控作用
        6.3.4 GMEC中脂滴分布情況
    6.4 小結(jié)
第七章 MiR-23a和miR-200a在山羊乳腺上皮細(xì)胞中的功能研究
    7.1 材料與方法
        7.1.1 主要試劑和儀器
        7.1.2 動(dòng)物樣品采集、總RNA提取
        7.1.3 細(xì)胞總RNA提取、cDNA合成和定量PCR
        7.1.4 油紅O含量與甘油三酯含量分析
        7.1.5 MiRNAs表達(dá)量之間的關(guān)聯(lián)分析
    7.2 結(jié)果
        7.2.1 MiR-23a過表達(dá)對乳脂合成的影響
        7.2.2 MiR-200a對乳脂合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響
        7.2.3 協(xié)同表達(dá)miRNAs的鑒定
    7.3 討論
        7.3.1 過表達(dá)miR-23a對乳脂合成的影響
        7.3.2 不同物種miR-200a的功能及其對GMEC乳脂代謝的影響
        7.3.3 乳脂代謝分子網(wǎng)絡(luò)的初步建立
    7.4 小結(jié)
結(jié)論
本研究的創(chuàng)新點(diǎn)
存在問題及展望
參考文獻(xiàn)
附錄
縮略詞表(Abbreviation)
致謝
作者簡介



本文編號：3981770