山羊乳中總脂肪含量,尤其是其中與人類健康密切相關的中短鏈脂肪酸及不飽和脂肪酸含量均高于牛乳。山羊乳的乳脂特點應與其乳腺乳脂代謝密切相關。然而,在乳脂代謝基因中,至今尚未發(fā)現(xiàn)山羊特異性表達或者具有特異功能的基因。據(jù)此推測山羊乳脂代謝的特點可能與其在基因不同水平(如轉錄后、翻譯水平)的調控機制有關。MicroRNAs (miRNAs)是一類在轉錄后水平調控基因表達的小分子RNA,其功能幾乎涉及生命活動的各個方面。已證實miRNAs是調控脂肪和肝臟組織中脂肪代謝的重要因子,然而,現(xiàn)有研究缺乏(?)niRNAs調控山羊乳腺乳脂代謝的研究報道。因此,本研究從miRNAs調控乳腺乳脂代謝的角度出發(fā),通過測序技術獲得西農薩能奶山羊乳腺組織miRNAs表達譜,分析其序列特征,檢測其在乳腺組織不同階段的表達水平,篩選與山羊乳脂代謝相關的miRNAs,并通過在山羊乳腺上皮細胞(GMEC)中過表達miRNAs,檢測細胞中與乳脂代謝相關的指標,證實miRNAs對山羊乳脂合成和組成具有重要影響,同時發(fā)現(xiàn)3對可在乳腺組織中協(xié)同表達的miRNAs,發(fā)現(xiàn)其協(xié)同調控山羊乳腺組織乳脂代謝。本研究從miRNAs調控角度闡明...

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 動物microRNAs(miRNAs)的生物學特征
        1.1.1 MiRNAs的生成
        1.1.2 MiRNAs的序列及功能特點
        1.1.3 MiRNAs調控下游基因表達的原理
        1.1.4 調控miRNAs表達的分子機制
    1.2 MiRNAs在動物生長、發(fā)育中的功能
        1.2.1 MiRNAs調控個體發(fā)育的功能
        1.2.2 MiRNAs調控哺乳動物組織發(fā)育的功能
        1.2.3 MiRNAs對乳腺發(fā)育的調控作用
    1.3 MiRNAs對脂質代謝的調控作用
        1.3.1 MiRNAs調控肝臟脂質代謝
        1.3.2 MiRNAs調控脂肪組織和細胞中的脂肪代謝
        1.3.3 MiRNAs調控其它組織和細胞中的脂質代謝
    1.4 乳腺組織乳脂代謝分子機制
        1.4.1 乳脂肪與其它組織中脂肪的區(qū)別
        1.4.2 山羊乳脂肪的組成特點及功能
        1.4.3 牛和小鼠乳腺組織乳脂代謝分子機制
        1.4.4 山羊乳脂代謝分子機制研究進展
    1.5 MiRNAs調控乳腺乳脂代謝分子機制研究進展
    1.6 本研究的目的意義
第二章 山羊乳腺組織miRNAs測序、生物信息學分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 主要試劑和儀器
        2.1.2 動物樣品采集、總RNA提取
        2.1.3 Solexa測序
        2.1.4 山羊乳腺組織miRNAs的生物信息學鑒定
        2.1.5 山羊miRNAs特征分析
    2.2 結果
        2.2.1 總RNA樣品檢測結果
        2.2.2 Solexa測序結果質量鑒定及小RNAs序列分析
        2.2.3 山羊乳腺組織miRNAs序列分析
    2.3 討論
        2.3.1 Solexa測序結果的質量
        2.3.2 山羊乳腺組織小RNAs長度分布與功能
        2.3.3 山羊miRNAs序列的生物信息學鑒定方法
        2.3.4 山羊保守miRNAs的序列特征
    2.4 小結
第三章 泌乳中期和干奶期山羊乳腺組織差異表達miRNAs的篩選及功能預測
    3.1 材料與方法
        3.1.1 主要試劑和儀器
        3.1.2 動物樣品采集及總RNA提取
        3.1.3 MiRNA cDNA合成與定量PCR
        3.1.4 MiRNAs靶基因預測、GO富集和KEGG通路分析
        3.1.5 山羊乳腺上皮細胞的培養(yǎng)
        3.1.6 催乳素試驗及細胞總RNA提取
    3.2 結果
        3.2.1 山羊乳腺組織泌乳中期和干奶期miRNAs表達分析
        3.2.2 差異表達miRNAs靶基因的功能預測
        3.2.3 調控山羊乳脂代謝miRNAs的篩選
    3.3 討論
        3.3.1 MiRNAs在不同動物乳腺組織中的表達情況
        3.3.2 MiRNAs對乳腺發(fā)育和脂肪代謝的調控作用
        3.3.3 激素對miRNAs表達的調節(jié)作用
    3.4 小結
第四章 腺病毒介導的miRNAs在乳腺上皮細胞中的過表達研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 腺病毒載體構建所用試劑、材料和儀器
        4.1.2 細胞培養(yǎng)所用試劑、材料和儀器
        4.1.3 腺病毒載體構建
        4.1.4 腺病毒載體pAd-miRNAs在HEK293細胞株中的包裝和擴繁
        4.1.5 病毒感染乳腺上皮細胞
        4.1.6 細胞核染色
    4.2 結果
        4.2.1 重組腺病毒質粒pAd-miRNAs的構建及鑒定
        4.2.2 pAd-miRNA包裝和病毒擴繁
        4.2.3 腺病毒介導miRNAs在GMEC中的過表達
    4.3 討論
    4.4 小結
第五章 MiR-103對山羊乳腺上皮細胞乳脂代謝的調控作用研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 主要試劑和儀器
        5.1.2 動物樣品采集、總RNA提取
        5.1.3 CDNA合成及定量PCR
        5.1.4 脂滴油紅O染色
        5.1.5 甘油三酯提取、含量測定
        5.1.6 脂肪酸提取、含量測定
        5.1.7 MiRNA inhibitor轉染乳腺上皮細胞
        5.1.8 相關性分析
    5.2 結果
        5.2.1 細胞中脂滴形態(tài)觀察結果
        5.2.2 甘油三酯含量測定結果
        5.2.3 脂肪酸含量分析結果
        5.2.4 乳脂生成相關基因mRNAs檢測結果
        5.2.5 其它乳脂代謝相關基因表達量檢測結果
        5.2.6 MiR-103表達量抑制試驗
        5.2.7 MiR-1031與泛酸酶基因(PANK3)表達量的關聯(lián)分析
    5.3 討論
        5.3.1 研究miR-103調控乳脂合成功能的重要性
        5.3.2 MiR-103對脂肪脂解、β-氧化的調控作用
        5.3.3 MiR-103-1與PANK3
    5.4 小結
第六章 MiR-27a對山羊乳腺上皮細胞乳脂代謝的調控作用研究
    6.1 材料與方法
        6.1.1 主要試劑和儀器
        6.1.2 細胞總RNA提取、cDNA合成和定量PCR試驗
        6.1.3 油紅O染色、甘油三酯含量測定及脂肪酸提取
        6.1.4 Western blotting
    6.2 結果
        6.2.1 細胞中脂滴形態(tài)觀察結果
        6.2.2 甘油三酯含量測定結果
        6.2.3 脂肪酸含量分析結果
        6.2.4 乳脂合成相關基因mRNAs定量檢測結果
        6.2.5 PPARγ表達量檢測結果
        6.2.6 脂肪分解和β-氧化相關基因表達量檢測結果
    6.3 討論
        6.3.1 MiR-27a對GMEC乳脂代謝的調控作用
        6.3.2 過表達miR-27a對不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比例的影響
        6.3.3 PPARγ對下游基因的調控作用
        6.3.4 GMEC中脂滴分布情況
    6.4 小結
第七章 MiR-23a和miR-200a在山羊乳腺上皮細胞中的功能研究
    7.1 材料與方法
        7.1.1 主要試劑和儀器
        7.1.2 動物樣品采集、總RNA提取
        7.1.3 細胞總RNA提取、cDNA合成和定量PCR
        7.1.4 油紅O含量與甘油三酯含量分析
        7.1.5 MiRNAs表達量之間的關聯(lián)分析
    7.2 結果
        7.2.1 MiR-23a過表達對乳脂合成的影響
        7.2.2 MiR-200a對乳脂合成相關基因mRNA表達的影響
        7.2.3 協(xié)同表達miRNAs的鑒定
    7.3 討論
        7.3.1 過表達miR-23a對乳脂合成的影響
        7.3.2 不同物種miR-200a的功能及其對GMEC乳脂代謝的影響
        7.3.3 乳脂代謝分子網絡的初步建立
    7.4 小結
結論
本研究的創(chuàng)新點
存在問題及展望
參考文獻
附錄
縮略詞表(Abbreviation)
致謝
作者簡介



本文編號：3981770