狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染引起的以侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的致死性人畜共患傳染病。RABV可以感染人及所有溫血?jiǎng)游?引起狂犬病,一旦發(fā)病致死率幾乎可達(dá)100%。本研究利用反向遺傳操作,通過(guò)將綠色熒光蛋白(GFP)基因克隆到狂犬病病毒載體的N和P基因之間,并且在Vero E6細(xì)胞上進(jìn)行重組病毒拯救,成功的拯救出攜帶GFP基因的重組狂犬病病毒rSAD-GFP,并對(duì)重組病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。通過(guò)測(cè)定病毒滴度,繪制生長(zhǎng)曲線,病毒滴度測(cè)定結(jié)果表明重組病毒與親本病毒在Vero E6細(xì)胞的生長(zhǎng)特性基本一致,兩種病毒生長(zhǎng)沒有顯著性差異;重組病毒在Vero細(xì)胞連續(xù)傳代數(shù)代,未發(fā)現(xiàn)外源基因丟失的現(xiàn)象。將拯救的重組病毒rSAD-GFP通過(guò)腦內(nèi)注射的方法感染BALB/C小鼠,通過(guò)該試驗(yàn)評(píng)價(jià)重組病毒的致病性,小鼠在重組病毒攻擊后,無(wú)可見的臨床癥狀和死亡現(xiàn)象,表明拯救的重組病毒屬于弱毒毒株。在構(gòu)建rSAD-GFP毒株成功的基礎(chǔ)上,我們利用該質(zhì)粒,構(gòu)建含有礦化基因W6的重組質(zhì)粒,并對(duì)外源礦化基因的插入位置進(jìn)行了一系列的研究,獲得了不同的重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞,但是未能...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖1.1狂犬病在全球的分布（Fooksetal2014）

全球一共有150個(gè)國(guó)家或地區(qū)報(bào)道過(guò)狂犬病的發(fā)生，如圖1.1所示，其中絕大多數(shù)病例集中在非洲、亞洲及拉丁美洲地區(qū)，患病人數(shù)居于前兩位的國(guó)家為印度和中國(guó)，流浪狗是主要的狂犬病感染動(dòng)物。2013年WHO(WHO,2013)報(bào)導(dǎo)全球近60000人死于狂犬病，大部分是非洲和亞....

圖1.2狂犬病毒粒子的結(jié)構(gòu)模式圖（MatthiasJ.Schnelletal.2010）

圖1.2狂犬病毒粒子的結(jié)構(gòu)模式圖（MatthiasJ.Schnelletal.2010）Fig.1.2Structureofrabiesvirusvirion犬病病毒的基因組結(jié)構(gòu)ABV的基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，大約12kb左右，編碼病毒....

圖2.1SAD毒株與重組SAD-GFP毒株的基因結(jié)構(gòu)

2.1.2方法2.1.2.1含有GFP基因的全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建重組全長(zhǎng)cDNA構(gòu)建示意圖見圖2.1。利用本實(shí)驗(yàn)室保存的含有GFP基因的質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增目的基因GFP。擴(kuò)增GFP基因的引物序列為：上游引物G....

圖2.2GFP的PCR擴(kuò)增結(jié)果

文第二章攜帶GFP基因的重組狂犬病病增和重組質(zhì)粒的構(gòu)建CR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸凝膠電泳鑒定，片段相符，陰性對(duì)照并無(wú)任何條帶。將PCR產(chǎn)測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明片段未突變，將提取的質(zhì)粒泳，純化回收目的片段。使用T4DNA連接酶進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果見圖2.3。....

本文編號(hào)：3977238