【目的】為建立能夠穩(wěn)定表達禽β-防御素9(AvBD9)的DF-1細胞系,并檢測其表達產(chǎn)物對耐藥大腸桿菌的抗菌活性�！痉椒ā繉vBD9基因克隆至慢病毒載體pLOV-eGFP中,將重組質(zhì)粒與psPAX2和pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝成含AvBD9基因的重組慢病毒,并將其感染DF-1細胞,通過嘌呤霉素篩選和純化,獲得穩(wěn)定表達AvBD9蛋白的DF-1細胞系。利用RT-PCR和Western blot驗證AvBD9基因在DF-1中的轉(zhuǎn)錄和表達;將細胞培養(yǎng)上清液與耐藥大腸桿菌混合培養(yǎng),檢測其抗菌效果,并用掃描電鏡觀察其對菌體的損傷情況�！窘Y(jié)果】篩選出了穩(wěn)定表達AvBD9的DF-1細胞系,且AvBD9在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均有表達;細胞培養(yǎng)上清使耐藥大腸桿菌的存活率低于55%,電鏡觀察顯示菌體皺縮,損傷嚴重�！窘Y(jié)論】成功建立能夠穩(wěn)定表達AvBD9的DF-1細胞系,為抗生素替代品的生產(chǎn)制備提供了借鑒思路,為進一步開展AvBD9的抗菌研究提供依據(jù)。

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【部分圖文】：

圖1pLOV-eGFP載體線性化以及含同源臂的AvBD9基因PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

根據(jù)材料和方法1.5，將pLOV-eGFP-AvBD9、pSPAX2和pMD2.G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，24h后，熒光顯微鏡下觀察瞬時轉(zhuǎn)染后綠色熒光信號分布。取293T細胞培養(yǎng)上清液感染DF-1細胞，以1μg/mL嘌呤霉素工作濃度進行細胞篩選后得到細胞多克隆，通過3輪有限稀....

圖2慢病毒包裝及細胞系篩選結(jié)果圖

細胞培養(yǎng)上清液與耐藥大腸桿菌作用不同時間后讀取吸光度，結(jié)果顯示：隨著孵育時間的增加，耐藥菌的存活率逐漸降低，孵育5h時多重耐藥大腸桿菌的存活率低于55%，但作用6h后，存活率開始上升（圖5）。表明AvBD9的抗菌效果同時間具有相關(guān)性。同時，掃描電鏡檢測抑菌活性發(fā)現(xiàn)，對照組菌體....

圖4AvBD9蛋白Westernblot檢測

圖2慢病毒包裝及細胞系篩選結(jié)果圖圖3DF-1-AvBD9細胞AvBD9基因檢測

圖3DF-1-AvBD9細胞AvBD9基因檢測

圖4AvBD9蛋白Westernblot檢測圖5DF-1-AvBD9細胞培養(yǎng)上清的抗菌活性

本文編號：3973287