為研究患有耐藥性奶牛乳房炎的致病菌毒力基因,本研究對(duì)從乳房炎患牛乳中分離鑒定的一株蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)2018CQ-CMM01株腸毒素基因(Enterotoxin,Ent)進(jìn)行了克隆與序列分析。采用PCR方法擴(kuò)增臨床分離株Ent基因片段,結(jié)果表明克隆基因全長(zhǎng)1 098bp,可編碼349個(gè)氨基酸;經(jīng)氨基酸序列分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)為堿性的疏水性蛋白,穩(wěn)定性弱,無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu),有5個(gè)跨膜區(qū)域;二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),延伸鏈為該蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)元素。核苷酸序列的同源性分析表明,與其他幾株腸毒素菌株相比,本研究中克隆的Ent基因(GeneBank登錄號(hào):MT814304)與B. cereus克隆Pnc9腸毒素FM樣基因部分序列(EF453659.1)相似度最高,為96.45%;Ent基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),本研究中Ent基因與中國(guó)菌株CP040336.1的同源性最高,與巴基斯坦B. cereus標(biāo)準(zhǔn)株CP026375.1,泰國(guó)株EF453659.1、EF453660.1等處于不同進(jìn)化分支,說(shuō)明該Ent基因與中國(guó)菌株CP040336.1遺傳距離最近;同時(shí)在Ent基因的ORF中存在...

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圖1Ent基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

通過(guò)對(duì)蠟樣芽孢桿菌2018CQ-CMM01株的活化培養(yǎng)，提取基因組DNA，利用EntF和EntR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)0.01g/mL的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，大約在1.100bp處有特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。2.2Ent基因序列測(cè)定

圖2Ent蛋白的疏水性分析

通過(guò)ProtParam程序分析得到，Ent蛋白理論分子質(zhì)量（MW）為40.324.06，分子式為C1844H2763N435O507S37，原子總數(shù)為5.586；理論等電點(diǎn)(pl)為8.52，為堿性氨基酸；在氨基酸組成上，Ser(S)49個(gè)，占14.....

圖3Ent蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)SOPMA平臺(tái)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ent蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成元素為延伸鏈，含141個(gè)，占40%，其次為無(wú)規(guī)則卷曲97個(gè)，占27.79%，α-螺旋95個(gè)，占27.22%，β-轉(zhuǎn)角16個(gè)，占4.58%（圖3），幾種結(jié)構(gòu)均無(wú)規(guī)律散在分布。2.3.3.Ent蛋白信號(hào)肽和跨膜區(qū)分析

圖4Ent基因蛋白跨膜區(qū)

經(jīng)SignalP數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白在其N端27～28位有僅29.98%的可能存在信號(hào)肽；TargetP2.0分析結(jié)果表明該序列切割位點(diǎn)存在的可能極低，為16.91%，綜合兩種軟件的分析結(jié)果，預(yù)測(cè)該Ent蛋白不存在信號(hào)肽或切割位點(diǎn)，是一種非分泌蛋白。利用TMHMM對(duì)Ent蛋白....

本文編號(hào)：3967676