本研究首先利用同源重組一步克隆法將雞傳染性貧血病病毒(CIAV)的VP3基因克隆到pGEX-6P-1原核表達(dá)載體上,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)及SDS-PAGE分析成功獲得了重組蛋白rGST-VP3的表達(dá)。隨即以純化的重組蛋白rGST-VP3免疫Balb/c小鼠,通過(guò)脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合以及間接免疫熒光(IFA)篩選,獲得2株穩(wěn)定分泌CIAV-VP3抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8;亞型鑒定表明,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均為IgG1;效價(jià)測(cè)定發(fā)現(xiàn),CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8的腹水間接免疫熒光效價(jià)分別為1:102 400與1:12 800;Western blot進(jìn)一步證實(shí),CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均能識(shí)別重組蛋白rGST-VP3。本研究結(jié)果為后期研究VP3蛋白在CIAV致病中作用及其誘導(dǎo)凋亡分子機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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圖2誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果

圖1重組載體PCR鑒定2.3抗VP3蛋白特異性單克隆抗體篩選及特性

圖4純化的重組蛋白rGST-VP3的Westernblot結(jié)果

圖3純化后的重組蛋白rGST-VP3SDS-PAGE結(jié)果3討論

圖1重組載體PCR鑒定

將破碎后的重組菌上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析表明,在35kDa左右出現(xiàn)特異性條帶,而且目的條帶主要存在于細(xì)菌破碎后的上清液中(圖2)。Westernblot結(jié)果顯示,以病毒免疫小鼠血清做一抗,在35kDa左右出現(xiàn)一條條帶(圖3),與預(yù)期結(jié)果相符。將誘導(dǎo)表達(dá)后細(xì)菌進(jìn)行超....

圖3純化后的重組蛋白rGST-VP3SDS-PAGE結(jié)果

以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VP3的DF-1細(xì)胞為抗原,通過(guò)IFA方法篩選出了2株與CIAV-VP3反應(yīng)的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株,分別挑取一個(gè)單克隆細(xì)胞建株命名為CIAV-VP3-4G8和CIAV-VP3-4D7,具體IFA熒光結(jié)果如圖5所示。將2株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞連續(xù)3次亞克隆,所有單克隆....

本文編號(hào)：3967511