利用PCR技術(shù)擴(kuò)增西尼羅病毒(WNV)E蛋白基因并將其插入原核表達(dá)載體pET-30a(+),構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a(+)-WNV-E,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化,利用His鎳柱親和層析法純化目的蛋白,純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE與Westernblot鑒定正確后,免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體并進(jìn)行間接免疫熒光鑒定。結(jié)果顯示:WNV E蛋白在大腸桿菌中以包涵體形式被成功表達(dá),蛋白最佳誘導(dǎo)條件為37℃,0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h,經(jīng)間接免疫熒光鑒定多克隆抗體能特異性識(shí)別WNV E蛋白。本研究成功表達(dá)并純化了WNV E蛋白,證明該蛋白具有良好的免疫原性,為WNV抗原、抗體檢測(cè)方法的建立和新型疫苗的研發(fā)及相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

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圖1PCR擴(kuò)增的WNVE基因的鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，在1200bp處出現(xiàn)1條很亮的特異性目的條帶（見(jiàn)圖1），與目的片段大小一致。2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

圖2重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-WNV-E的PCR鑒定

將酶切后的目的片段與pET-30a（+）片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)HST08，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)1200bp的目的片段�；驕y(cè)序結(jié)果與GenBank中收錄的基因序列的同源性為100%，表明目的基因已被正確插入（見(jiàn)圖2）....

圖3目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot鑒定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，用IPTG進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至NC膜，以小鼠源His單克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行Western-blot鑒定，結(jié)果（見(jiàn)圖3）顯示，在44ku處出現(xiàn)特異性目的條....

圖4不同溫度誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

感染重組桿狀病毒rBacmid-E的Sf9細(xì)胞出現(xiàn)特異性熒光（見(jiàn)圖9A），而正常的Sf9細(xì)胞未出現(xiàn)熒光（見(jiàn)圖9B），表明小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗WNVE蛋白多克隆抗體能夠特異性識(shí)別E蛋白，證明E蛋白具有良好的免疫原性。圖5不同誘導(dǎo)濃度表達(dá)的重組蛋白的SDS-PAGE分析

本文編號(hào)：3966057