利用PCR技術擴增西尼羅病毒(WNV)E蛋白基因并將其插入原核表達載體pET-30a(+),構建重組質粒pET-30a(+)-WNV-E,并轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中,經IPTG誘導目的蛋白表達,對誘導條件進行優(yōu)化,利用His鎳柱親和層析法純化目的蛋白,純化后的蛋白經SDS-PAGE與Westernblot鑒定正確后,免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體并進行間接免疫熒光鑒定。結果顯示:WNV E蛋白在大腸桿菌中以包涵體形式被成功表達,蛋白最佳誘導條件為37℃,0.8 mmol/L IPTG誘導5 h,經間接免疫熒光鑒定多克隆抗體能特異性識別WNV E蛋白。本研究成功表達并純化了WNV E蛋白,證明該蛋白具有良好的免疫原性,為WNV抗原、抗體檢測方法的建立和新型疫苗的研發(fā)及相關研究奠定了基礎。

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【部分圖文】：

圖1PCR擴增的WNVE基因的鑒定

PCR擴增產物經10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，在1200bp處出現1條很亮的特異性目的條帶（見圖1），與目的片段大小一致。2.2重組質粒的構建與鑒定

圖2重組表達質粒pET-30a(+)-WNV-E的PCR鑒定

將酶切后的目的片段與pET-30a（+）片段進行連接，連接產物轉化至感受態(tài)HST08，提取重組質粒，進行PCR鑒定，經10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1200bp的目的片段。基因測序結果與GenBank中收錄的基因序列的同源性為100%，表明目的基因已被正確插入（見圖2）....

圖3目的蛋白誘導表達產物的Western-blot鑒定

將重組質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3）感受態(tài)細胞中，用IPTG進行目的蛋白的誘導表達，表達產物經SDS-PAGE，轉至NC膜，以小鼠源His單克隆抗體為一抗，HRP標記的山羊抗小鼠IgG為二抗進行Western-blot鑒定，結果（見圖3）顯示，在44ku處出現特異性目的條....

圖4不同溫度誘導重組蛋白表達產物的SDS-PAGE分析

感染重組桿狀病毒rBacmid-E的Sf9細胞出現特異性熒光（見圖9A），而正常的Sf9細胞未出現熒光（見圖9B），表明小鼠體內產生的抗WNVE蛋白多克隆抗體能夠特異性識別E蛋白，證明E蛋白具有良好的免疫原性。圖5不同誘導濃度表達的重組蛋白的SDS-PAGE分析

本文編號：3966057