發(fā)布時(shí)間：2024-04-13 08:24

　　目的:使用巴斯德畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白進(jìn)行體外表達(dá),通過動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)對(duì)其免疫原性和免疫保護(hù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法:從NCBI基因數(shù)據(jù)庫獲取雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的基因序列,在序列兩端分別添加Xho Ⅰ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和6×His標(biāo)簽基因序列,根據(jù)X33畢赤酵母密碼子的偏好性對(duì)VP2蛋白的基因序列進(jìn)行優(yōu)化。運(yùn)用基因重組技術(shù)構(gòu)建含VP2蛋白基因的重組表達(dá)載體pwPICZa-VP2,將其導(dǎo)入X33畢赤酵母構(gòu)建重組畢赤酵母。大量表達(dá)VP2蛋白并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot驗(yàn)證。進(jìn)行動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn):VP2蛋白分為10μg、40μg、160μg、10μg+佐劑、40μg+佐劑和160μg+佐劑組給雞免疫,B87疫苗作為陽性對(duì)照、PBS作為陰性對(duì)照。通過外周血淋巴細(xì)胞增殖和病毒抗體檢測(cè)探究VP2蛋白在細(xì)胞免疫和體液免疫方面的作用。用BC6/85毒株感染雞,對(duì)VP2蛋白的免疫保護(hù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果:考馬斯亮藍(lán)染色、Western blot和去糖基化分析表明,體外成功表達(dá)了 VP2蛋白。外周血淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果表明,VP2蛋白對(duì)細(xì)胞免疫沒有影響。...

【文章頁數(shù)】：47 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１?１ＢＤＶ基因組模式圖［１３］??Ｆｉｇ．?１?Ｇｅｎｏｍｉｃ?ｐａｔｔｅｒｎ?ｆｉｇｕｒｅ?ｏｆ?ＩＢＤＶ??

病毒基因組由大片段Ａ和小片段Ｂ兩段雙鏈ＲＮＡ?（ｄｓＲＮＡ）??組成，結(jié)構(gòu)如圖１。小片段Ｂ?（２．８ｋｂｐ）包含一個(gè)單一的開放閱讀框（ＯＲＦ）編碼ＶＰ１??蛋白，ＶＰ１是一種具有ＲＮＡ依賴的ＲＮＡ聚合酶活性的蛋白質(zhì)剛。大片段Ａ?（３．２ｋｂｐ）??包含兩個(gè)重疊的開放閱讀框。一個(gè)小....

圖１ＶＰ２基因雙酶切鑒定；Ｍ：?ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)（ｂｐ）??Ｆ．ｉｆｉｃｉｎ２ｅｎｌｅｎｚｍｔｉＭｒ

３．１目的基因酶切鑒定??將公司合成的含ＶＰ２基因的大腸桿菌培養(yǎng)后，提取含ＶＰ２基因載體用瓜〇?Ｉ和ＥｃｏＲ??Ｉ進(jìn)行雙酶切，１％瓊脂糖凝膠電泳如圖１，載體大小為１８６５?ｂｐ，切下的片段大小與１３８６??ｂｐ的ＶＰ２基因一致。??Ｈ??７ＳＱ?ｇｌＢＭｉｌｉｌ—ＳＩ??圖１ＶＰ....

圖２重組表達(dá)載體雙酶切鑒定；Ｍ：?ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)（ｂｐ）??Ｆｉｇ．２?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ?ｂｙ?ｄｏｕｂｌｅ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ；?Ｍ：?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?（ｂｐ）??

３．２重組表達(dá)載體構(gòu)建??將ＶＰ２基因膠回收與ｐｗＰＩＣＺａ表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)提質(zhì)粒，用油〇??１和￡〇＞１１１進(jìn)行雙酶切，１％瓊脂糖凝膠電泳如圖２，表達(dá)載體３６００?ｂｐ，切下片段大小??與１３８６?ｂｐ的ＶＰ２基因一致，說明ＶＰ２基因己經(jīng)成功連接表達(dá)載體。??－....

圖３重組畢赤酵母ＰＣＲ鑒定；Ｍ：?ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)（ｂｐ）??Ｆｉ．３?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?Ｐｉｃｈｉａａｓｔｏｒｉｓ?ｂＰＣＲ；?Ｍ：?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒｂ

３．３重組畢赤酵母的ＰＣＲ鑒定??對(duì)電轉(zhuǎn)化后的重組畢赤酵母在選擇性固體培養(yǎng)基上挑選出的單菌落進(jìn)行菌落ＰＣＲ，??１％瓊脂糖凝膠電泳如圖３，在１０００?ｂｐ與２０００?ｂｐ之間擴(kuò)增出很亮的條帶，與１３８６?ｂｐ??的ＶＰ２蛋白基因大小符合，說明挑選的重組畢赤酵母單菌落含有ＶＰ２蛋白....

本文編號(hào)：3952752